Universität zu Köln

Bhandari, Deepak (2015). Structure-function analysis of the Arabidopsis EDS1 immune regulatory complex. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Activation of plant innate immune responses by intracellular receptors involves dynamic changes in the subcellular localisations, assemblies and activities of signalling complexes. The A. thaliana nucleocytoplasmic protein EDS1, together with its signalling partners PAD4 and SAG101, coordinates basal and TNL receptor-triggered cell defence reprogramming in response to pathogens. EDS1, PAD4 and SAG101 genes exist in all seed plants and form a plant-specific family with a N-terminal lipase-like domain and a unique C-terminal EP (EDS1-PAD4) domain. Functional analysis of the crystal structure of an A. thaliana EDS1-SAG101 heterodimer showed that EDS1 forms molecularly distinct heterodimers with its partners through a large conserved interface. EDS1 heterodimer formation is chiefly driven by the juxtaposed lipase-like domains and is essential for EDS1 disease resistance signalling. The EDS1 lipase-like domain without its EP domain is stable but insufficient for immunity. These features suggested a key role of the EP domain. To gain functional insights to EP domain function, the EDS1-SAG101 heterodimer crystal structure was used to generate EP domain mutants that were defective in resistance signalling but retained a nucleocytoplasmic distribution and direct partner interactions. Functional analysis of the EDS1 EP domain variants revealed two conserved residues (K478 and R493) that are important for A.thaliana basal and TNL immunity. Mutation of K478 to arginine (K478R) or R493 to alanine (R493A) led to a partial and complete loss of TNL resistance, respectively. These mutants were completely compromised in EDS1-mediated basal resistance. Disease susceptibility of K478R and R493A in TNL resistance to bacterial pathogen strains is due to their failure to counteract virulence activity of the phytotoxin coronatine (a jasmonic acid-isoleucine conjugate mimic). EDS1-dependent transcriptional defence reprogramming over a 24 h time course after TNL activation is delayed in R493A and this causes delayed accumulation of the important stress hormone, salicylic acid (SA). Coronatine does not affect the SA accumulation profile of this mutant, although it suppresses SA accumulation in wild-type plants. By contrast, wild-type like SA accumulation in the K478R mutant in TNL resistance suggests two distinct activities of EDS1 EP domain: one is to promote the SA pathway (intact in K478R and defective in R493A), the second is to antagonize coronatine-promoted JA outputs (defective in both mutants) in disease resistance signalling. Further targeted mutational analysis shows that a positively charged residue at R493 is vital for EDS1 immunity functions and correlates with an ability of EDS1 to bind to nucleic acid in situ. Results presented here identify amino acids in the EP domain that are important for two different EDS1 signalling outputs and suggest that EDS1 chromatin association is integral to EDS1 immune function. This protein structure-function study provides tools to dissect the molecular function and interactions of this central plant immune regulatory node.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Aktivierung der pflanzlichen Immunantwort durch intrazelluläre Rezeptoren unterliegt dynamischen Änderungen der subzellulären Lokalisation, der Zusammensetzung und der Funktionen signaltransduzierender Komplexe. In A.thaliana wird die basale und die TNL Rezeptor-vermittelte Reprogrammierung zellautonomer Pathogenabwehr durch das nukleo-zytoplasmische Protein EDS1, zusammen mit seinen signalgebenden Partnern PAD4 und SAG101, übertragen. EDS1, PAD4 und SAG101 existieren in allen Samenpflanzen und bilden eine pflanzenspezifische Genfamilie, welche für eine lipaseähnliche Domäne am C-Terminus und eine einzigartige C-terminale EP (EDS1-PAD4) Domäne kodieren. Die funktionelle Analyse der Kristallstruktur eines A.thaliana EDS1-SAG101 Heterodimers zeigte, dass EDS1 mit seinen Signalpartnern individuelle Komplexe über eine große, konservierte molekulare Oberfläche bildet. Die Formierung des EDS1 Heterodimers ist hauptsächlich durch die nebeneinandergestellten lipaseähnlichen Domänen bedingt und ist für die EDS1-vermittelte Immunantwort unverzichtbar. Die lipaseähnliche EDS1-Domäne ist auch ohne EP-Domäne stabil, jedoch in ihrer Funktionalität ungenügend für eine Immunantwort. Diese Eigenschaften suggerieren eine Schlüsselfunktion der EP-Domäne für die EDS1-vermittelte Immunantwort. Um weitere Erkenntnisse über die Funktion der EP-Domäne zu gewinnen, wurde die EDS1-SAG101 Kristallstruktur zur Entwicklung neuer Mutationen innerhalb der EP-Domäne genutzt. Ziel war dabei die Entwicklung von Varianten, welche in der Signalweiterführung zur Resistenzausbildung beeinträchtigt sind, jedoch nicht in der nukleo-zytoplasmatischen Verteilung des Proteins oder bekannten, direkten Protein-Protein Interaktionen. Die funktionelle Untersuchung dieser Varianten der EDS1 EP-Domäne entschlüsselte zwei konservierte Aminosäuren (K478 und R493), welche in der basalen und der TNL Immunantwort in A.thaliana eine wichtige Rolle spielen. Mutationen der Aminosäure K478 zu Arginin (K478R) oder R493 zu Alanin (R493A) führten entsprechend zu einem partiellen oder völligen Verlust der TNL Resistenz. Beide Mutationen verursachten zudem einen kompletten Ausfall der EDS1-abhängigen basalen Resistenz. Die resultierende erhöhte Anfälligkeit der K478R- und R493A-Varianten gegenüber bakteriellen Pathogenen konnte im Weiteren auf den Verlust der Fähigkeit zurückgeführt werden, der virulenten Aktivität des Phytotoxins Coronatin (Ein Imitator des Jasmonsäure[JA]-Isoleucin Konjugats) entgegen zu wirken. Die EDS1-abhängige transkriptionelle Reprogrammierung während der Pathogenabwehr ist über einen Zeitraum von 24 Stunden nach TNL-Aktivierung in R493A verzögert und führt zu einer Verzögerung in der Akkumulation des wichtigen Stresshormons Salizylsäure (SA). Coronatin beeinflusst die SA-Akkumulation in dieser Mutante nicht, wenngleich es die SA-Akkumulation im Wildtyp unterdrückt. Im Gegensatz dazu konnte eine Wildtyp-ähnliche SA-Akkumulation in der K478R-Mutante in der TNL Immunantwort beobachtet werden. Dies legt zwei unterschiedliche Funktionen der EDS1 EP-Domäne nahe: Eine in der Verstärkung der SA Biosynthese und Signalwege (Intakt in K478R und defekt in R493A), die andere Funktion liegt im Entgegenwirken Coronatin-verstärkter JA signale (Defekt in beiden Mutanten). Die Analyse weiterer gezielter Mutationen zeigt, dass ein positiv geladener Aminosäurerest an R493 wichtig für die Funktion von EDS1 in der Immunantwort ist und mit der Fähigkeit von EDS1 korreliert in situ an Nukleinsäuren zu binden. Die hier präsentierten Ergebnisse führen zur Identifikation von Aminosäuren in der EP-Domäne, die für die Funktion von EDS1 in zwei unterschiedlichen Signalwegen von Bedeutung sind. Zudem legen sie nahe, dass die physische Assoziation von EDS1 mit Chromatin von wesentlicher Bedeutung für die Funktion von EDS1 in der pflanzlichen Immunantwort ist. Diese Proteinstruktur- und Proteinfunktionsstudie liefert zudem die nötigen Werkzeuge zur Entschlüsselung der molekularen Funktion und der Interaktionen für diesen zentralen Knotenpunkt in der pflanzlichen Immunantwort. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bhandari, Deepak bhandari@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-71404
Date:	November 2015
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Mathematics and Science Education > Institute of Biology Education
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis, immunity, EDS1, Structural analysis English
Date of oral exam:	26 January 2016
Referee:	Name Academic Title Parker, Jane Prof. Dr. Zuccaro, Alga Prof. Dr. Banfield, Mark Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7140