Universität zu Köln

Adler, Stephanie (2024). Untersuchung des mikrovillären Bürstensaums im C. elegans Darmepithel mittels Puls-RNAi. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Enterozyten, die den Metazoen-Darm auskleiden, besitzen an ihrer apikalen Oberfläche Aktin-basierte Membranausstülpungen, so genannte Mikrovilli, um durch diese Oberflächenvergrößerung eine erhöhte Nährstoffaufnahme zu erreichen. Dieser Bürstensaum ist ein wesentliches Merkmal des Darms von C. elegans. Die Besonderheit, dass der Darm aus einer definierten Zellzahl von nur 20 Enterozyten besteht, die sich aufgrund fehlender intestinaler Stammzellen lebenslang nicht erneuern können, wirft eine spannende Frage auf: Ist eine Kompensation von Defekten im mikrovillären Bürstensaum durch die vorhandenen Enterozyten möglich? Um diese Frage zu beantworten, wurde Puls-RNAi durch Fütterung in Form einer temporären Exposition auf RNAi-Platten etabliert. Permanente und Puls-RNAi gegen act-5 und aps-1 schädigte das Darmepithel während der embryonalen und postembryonalen Entwicklung, indem die Fluoreszenzsignale der Mikrovilli-Marker ACT-5::YFP und PEPT-1::DsRed reduziert wurden. Im Wildtyp N2 war die Untersuchung der Langzeitauswirkungen auf Entwicklung und Reproduktion nach embryonaler Puls-RNAi aufgrund des Auftretens embryonaler Letalität, bedingt durch die Sequenzähnlichkeit des act-5 Gens zu den anderen Aktin-Genen (act-1, act 2, act-3, act-4), nicht möglich. In den Stämmen OLB11 und JM125, die eine darmspezifische bzw. reduzierte Sensitivität gegenüber RNAi aufweisen, führte embryonale Puls-RNAi zu einer verzögerten Entwicklung und einer reduzierten Nachkommenzahl. Die Möglichkeit, dass der RNAi-Effekt in Abhängigkeit von der Pulslänge auch nach dem Transfer auf Kontrollplatten erhalten bleibt, wurde anhand von postembryonaler Puls-RNAi in einem weiteren Epithelgewebe, der Spermathek, gezeigt. Kurze postembryonale Puls-RNAi gegen act-5 führte ebenfalls zu einer verzögerten Larval- und Adultentwicklung sowie zu einer reduzierten Nachkommenzahl. Es ist also möglich, die Bildung des mikrovillären Bürstensaums in der frühen Entwicklung zu stören. Die Kompensation der Defekte in den Enterozyten von C. elegans beruht wahrscheinlich auf einer physiologisch erhöhten Expression nach Abnahme des RNAi-Effekts im weiteren Entwicklungsverlauf. Die Untersuchung der Langzeiteffekte auf Entwicklung und Nachkommenzahl wurde auf weitere Komponenten des Transportprozesses in C. elegans Enterozyten ausgeweitet, die für den mikrovillären Bürstensaum wichtig sind. Während darmspezifische Dauer-RNAi gegen rab-11.1 die Anzahl der F1-Nachkommen in P0 reduzierte und zu einer verzögerten Entwicklung führte, wurde dies bei Dauer-RNAi gegen par-5 und cdh-5 nicht beobachtet. Das Mikrotubuli-Netzwerk im Darm von C. elegans wurde während der Entwicklung durch das Fluoreszenzsignal des Mikrotubuli-assoziierten Proteins MAPH-1.1 visualisiert. Die Auswertung der Nachkommenzahl nach darmspezifischer Tubulin-RNAi gibt Aufschluss darüber, welche Tubulin-Isoformen im Darm konkret beteiligt sind. Die Veränderung des Fluoreszenzsignals von MAPH-1.1 nach Tubulin-RNAi lässt auf die Beteiligung einzelner Tubulin-Isoformen schließen, was die Komplexität des Mikrotubuli-Netzwerks unterstreicht.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Enterocytes lining the metazoan intestine have actin-based membrane protrusions called microvilli on their apical surface to enhance nutrient uptake. This microvilli-like brush border is an essential feature of the C. elegans intestine. The peculiarity that it consists of a defined cell number of only 20 enterocytes, which cannot renew themselves for life due to the lack of intestinal stem cells, raises an exciting question: Can the existing enterocytes compensate for defects in the microvillar brush border? To answer this question, pulse RNAi was established by feeding in the form of transient exposure to RNAi plates. Permanent and pulse RNAi against act-5 or aps-1 damaged the intestinal epithelium during embryonic and postembryonic development by reducing the fluorescence signals of the microvilli markers ACT 5::YFP and PEPT-1::DsRed. In wild-type N2, it was not possible to study long-term effects on development and reproduction after embryonic pulse RNAi because of embryonic lethality caused by the sequence similarity of the act-5 gene to the other actin genes (act-1, act-2, act-3, act-4). In the OLB11 and JM125 strains, which exhibit intestine-specific and reduced sensitive to RNAi, respectively, embryonic pulse RNAi resulted in delayed development and reduced number of offspring. The possibility that the pulse length-dependent RNAi effect persists after transfer to control plates was demonstrated using postembryonic pulse RNAi in another epithelial tissue, the spermatheca. Short postembryonic pulse RNAi against act-5 also resulted in delayed larval and adult development and reduced number of offspring. Thus, it is possible to disrupt the formation of the microvillus brush border in early development. The compensation of the defects in C. elegans enterocytes is probably based on a physiologically increased expression after a decrease of the RNAi effect in the further course of development. The investigation of long-term effects on development and progeny number was extended to other components of the transport process in C. elegans enterocytes that are important for the microvillous brush border. While intestine-specific permanent RNAi against rab 11.1 reduced the number of F1 progeny in P0 and led to delayed development, this was not observed with permanent RNAi against par-5 and cdh-5. The microtubule network in the intestine of C. elegans was visualized during development using the fluorescence signal of the microtubule-associated protein MAPH-1.1. Evaluation of the number of offspring after intestine-specific tubulin RNAi provides information on which tubulin isoforms are specifically involved in the intestine. The change in fluorescence signal of MAPH-1.1 after tubulin RNAi indicates the involvement of individual tubulin isoforms and underscores the complexity of the microtubule network. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Adler, Stephanie stephanie_adler@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-736764
Date:	2024
Language:	German
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Anatomie > Institut I für Anatomie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Caenorhabditis elegans; Darm; RNAi; Mikrovilli; Bürstensaum German Caenorhabditis elegans; intestine; RNAi; microvilli; brush border English
Date of oral exam:	3 September 2024
Referee:	Name Academic Title Scaal, Martin Prof. Dr. Kroiher, Michael PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/73676