Universität zu Köln

Bechtel, Hanna (2024). Activator and inhibitor interactions and expression during trichome patterning in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The establishment of trichome fate is a well-studied de novo patterning process in the model organism A. thaliana. The regulatory networks underlying the patterning machinery are extensively researched but some processes remain elusive. The interplay between mathematic models describing biological patterns and experimental observations led to the establishment of trichome patterning models. These models can precisely predict the wildtype trichome pattern but face limitations in explaining more complex trichome phenotypes. Additionally, variables in these models are estimated and not based on experimental data, such as protein production and degradation rates. Moreover, some assumptions of the models have not been verified in biological experiments yet, like a positive feedback loop of activators on their own gene expression or the movement of activators. In the presented study, different aspects of trichome patterning were examined to shed light on some unresolved questions. To generate data on protein stability, production, and degradation rates, viral “self-cleavage” sites were utilized to express desired trichome patterning genes in a ratiometric amount with an internal control. These experiments revealed stabilization of MYB proteins in the presence of bHLH proteins but not vice versa. Moreover, a destabilization of the bHLH protein GL3 through itself was uncovered. These stability changes were found to be dependent on protein-protein interactions, and a putative link to the proteasomal degradation of these proteins was discovered. Additionally to protein studies, the gene expression of several regulatory sequences involved in trichome patterning was examined regarding their cis-regulatory elements and transactivation by various patterning genes. Mutation of WRKY-binding sites in the second intron of GL3 revealed that they are not involved in GL3 expression control, indicating other mechanisms. Overall, GL3 expression was not affected to a high degree by the presence of any tested trichome patterning gene, and more importantly, in this setup, a decrease of GL3 expression by its own presence could not be verified. Interestingly, the rescue experiments using different GL1 regulatory sequences may indicate a missing enhancer element due to low rescue efficiency. The examined genomic sequence of GL1 may include silencer elements that are masked due to the experimental procedures using artificially increased gene expression for rescue experiments. Additionally, for GL1, a positive feedback loop was observed in combination with GL3, TTG1, and TTG2 expression; which may resolve one missing link regarding patterning models. Finally, rescue experiments using Cardamine R2R3MYB sequences led to the surprising partial rescue of Arabidopsis gl1 mutant trichome phenotypes, indicating conserved protein functions as well as a degree of conserved regulatory sequences across species. Interestingly, ChWER was able to induce trichomes in gl1, revealing a potential divergence in trichome and root hair formation between species.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Etablierung des Trichomschicksals ist ein gut untersuchter de novo-Musterungsprozess im Modellorganismus A. thaliana. Die regulatorischen Netzwerke, die der Musterungsmaschinerie zugrunde liegen, sind umfassend erforscht, aber einige Prozesse bleiben schwer fassbar. Das Zusammenspiel zwischen mathematischen Modellen, die biologische Muster beschreiben, und experimentellen Beobachtungen führte zur Etablierung von Trichommusterbildungsmodellen. Diese Modelle können das Trichommuster des Wildtyps präzise vorhersagen, haben jedoch Einschränkungen bei der Erklärung komplexerer Trichomphänotypen. Darüber hinaus werden bestimmte Parameter in diesen Modellen geschätzt und basieren nicht auf experimentellen Daten, wie z. B. Proteinproduktion und Abbauraten. Darüber hinaus wurden einige Annahmen der Modelle noch nicht in biologischen Experimenten verifiziert, wie z. B. eine positive Rückkopplungsschleife von Aktivatoren auf ihre eigene Genexpression oder die Bewegung von Aktivatoren. In der vorgestellten Studie wurden verschiedene Aspekte der Trichommusterbildung untersucht, um einige ungelöste Fragen zu beleuchten. Um Daten zur Proteinstabilität, -produktion und -abbauraten zu generieren, wurden virale „Selbstspaltungsstellen“ verwendet, um gewünschte Trichommusterbildungsgene in einer ratiometrischen Menge mit einer internen Kontrolle zu exprimieren. Diese Experimente zeigten eine Stabilisierung von MYB-Proteinen in Gegenwart von bHLH-Proteinen, aber nicht umgekehrt. Darüber hinaus wurde eine Destabilisierung des bHLH-Proteins GL3 durch sich selbst aufgedeckt. Diese Stabilitätsänderungen erwiesen sich als abhängig von Protein-Protein-Interaktionen, und es wurde ein mutmaßlicher Zusammenhang mit dem proteasomalen Abbau dieser Proteine entdeckt. Zusätzlich zu den Proteinstudien wurde die Genexpression mehrerer regulatorischer Sequenzen, die an der Trichommusterbildung beteiligt sind, hinsichtlich ihrer cis-regulatorischen Elemente und der Transaktivierung durch verschiedene Musterbildungsgene untersucht. Die Mutation von WRKY-Bindungsstellen im zweiten Intron von GL3 ergab, dass sie nicht an der GL3-Expressionskontrolle beteiligt sind, was auf andere Mechanismen hindeutet. Insgesamt wurde die GL3-Expression durch die Gegenwart der getesteten Trichommusterbildungsgene nicht in hohem Maße beeinflusst, und was noch wichtiger ist: In diesem Aufbau konnte eine Verringerung der GL3-Expression durch die eigene Gegenwart nicht nachgewiesen werden. Interessanterweise könnte die Untersuchung verschiedener GL1-regulatorischer Sequenzen auf ein fehlendes Enhancer-Element hinweisen. Die untersuchte Genomsequenz von GL1 kann Silencer-Elemente enthalten, die aufgrund der bisher verwendeten experimentellen Verfahren maskiert sind. Zusätzlich wurde für GL1 eine positive Rückkopplungsschleife in Kombination mit der Expression von GL3, TTG1 und TTG2 beobachtet, was ein fehlendes Bindeglied in Bezug auf Musterbildungsmodelle sein könnte. Schließlich führten Rettungsexperimente mit Cardamine R2R3MYB-Sequenzen zur überraschenden teilweisen Rettung der Trichomphänotypen von Arabidopsis gl1 Mutanten, was auf konservierte Proteinfunktionen sowie ein gewisses Maß konservierter regulatorischer Sequenzen über Arten hinweg hinweist. Interessanterweise konnte ChWER Trichome in gl1 induzieren, was eine mögliche Divergenz in der Trichom- und Wurzelhaarbildung zwischen Arten aufzeigte. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bechtel, Hanna hanna.bechtel@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-737593
Date:	2024
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language trichome patterning UNSPECIFIED P2A sequences UNSPECIFIED protein stability UNSPECIFIED cis-regulatory sequences UNSPECIFIED Arabidopsis thaliana UNSPECIFIED
Date of oral exam:	9 September 2024
Referee:	Name Academic Title Hülskamp, Martin Prof. Dr. Höcker, Ute Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/73759