Universität zu Köln

Bach, Franziska (2024). Evaluation of scFvs based on HIV-1 Broadly Neutralizing Antibodies as a potential Binding Domain of CAR T Cells. PhD thesis, Universität zu Köln.

PDF Dissertationschrift Franziska Bach.pdf - Accepted Version Download (1MB)

Abstract

With almost 39 million infected people worldwide and a lack of curative therapy options, HIV infection still plays an important role in our health system, as well as in research. The human immune response generally fails to control HIV-1 infection and to target the HIV-1 reservoir and despite decades of research, both an effective HIV-1 vaccine and a curative therapy remain elusive. The most successful measure to date in the treatment of HIV-1 infection is antiretroviral therapy, which suppresses the virus plasma level. This lifelong therapy could significantly reduce the imortality rate and led to an almost normal life expectancy. However, a cure has not been achieved. so research into new and innovative therapeutic approaches, in addition to preventive strategies, is still necessary. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells are a promising approach. These genetically modified T cells are engineered to bypass regular HLA- dependent mechanisms of T cell activation. Antigen-binding of CAR T cells is typically achieved by employing antibody-derived single chain variable fragments (scFvs). These scFvs are engineered proteins expressed on the surface and they retain the antigen-recognition specificity of the original antibody, allowing CAR T cells to target specific cell surface antigens. Recently identified highly potent broadly neutralizing antibodies (bNAbs) targeting conserved envelope epitopes are defined by their remarkable neutralization activity against many globally circulating HIV-1 strains. In early phase clinical trials, bNAbs were generally well tolerated and demonstrated significant antiviral activity in viremic HIV-1-infected individuals, highlighting the great potential of immunotherapy of HIV-1 infection. The aim of this work is a systematic investigation of bNAb derived scFvs to test their suitability as a possible binding site of CAR T cells and to gain information about scFv affinity and specificity leading to enhanced CAR T cell persistence and efficacy. Ten potent neutralizing antibodies which bind to different epitopes on the HIV surface protein including the CD4 binding site, the V1/V2 loop, the V3-stem, and the Membrane Proximal External Region (MPER), as well as CD4 and a control antibody were generated in order to characterize the properties of the scFv antibodies and to compare them with the respective IgG4 and IgG1 antibodies. The antibody constructs were tested in different assays, as well as in a non-humanized mouse model. The results demonstrated that binding characteristics of bNAb-derived scFvs are only slightly weakened compared to full-length antibodies when measured by ELISA and flow cytometry. Moreover, autoreactive properties determined by a HEp-2 cell assay showed similar results for 8 the antibody constructs. However, the neutralization activity of full-length antibodies against different HIV-1 strains were higher. Furthermore, it could be shown that the generated scFv and IgG4 antibodies achieved longer half-lives after intravenous injection in non-humanized mice compared to the IgG1 antibodies. At last, a humanized mouse model was established to study new treatment approaches and immune responses. Overall, it could be shown that scFvs offer promising features as a binding domain of bNAb-derived CAR T cells and the results form the basis for the that scFvs are a crucial component of CAR T cells, allowing for the specific recognition and binding of target antigens.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Evaluation von Einzelstrang Antikörpern basierend auf anti HIV-1 breit neutralisierenden Antikörpern als potentielle Bindungsstelle von CAR T Zellen German
Translated abstract:	Abstract Language Mit weltweit fast 39 Millionen Infizierten ist die HIV-1-Infektion nicht nur ein bedeutendes Thema in den globalen Gesundheitssystemen, sondern spielt auch in der Infektionsforschung eine bedeutende Rolle. Eigenständig ist das menschliche Immunsystem nicht in der Lage die HIV-1-Infektion zu kontrollieren und das latente Reservoir zu eliminieren. Die bislang erfolgreichste Maßnahme in der Behandlung der HIV-1-Infektion ist die antiretrovirale Therapie. Erkrankte müssen hierfür täglich eine Kombination aus verschiedenen Medikamenten einnehmen, die das Virus-Plasmalevel unterdrücken. Diese lebenslang einzunehmende Therapie kann die Sterberate erheblich senken und führt zu einer nahezu normalen Lebenserwartung. Eine Heilung der Krankheit konnte allerdings bislang nicht erreicht werden. Die Erforschung neuer und innovativer Therapieansätze ist neben Präventionsstrategien daher weiterhin dringend erforderlich. Ein vielversprechender Ansatz sind Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen als neue Therapiemöglichkeit. Diese genetisch veränderten T-Zellen können reguläre HLA-abhängige Mechanismen der T-Zell-Aktivierung umgehen. Die Antigenbindung wird durch sogenannte Einzelstrang-Antikörper (single chain variable fragments (scFv)) ermöglicht, welche jeweils aus der variablen schweren und leichten Kette eines Antikörpers bestehen, und auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Hierdurch wird die Antigenspezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten und die Bindung spezifischer Zelloberflächenantigene ermöglicht. Das Ziel dieser Arbeit ist die systematische Untersuchung der scFvs, um ihre Eignung als mögliche Bindungsstelle von CAR-T-Zellen zu testen und Informationen über die Affinität und Spezifität von scFvs zu gewinnen. Auf Basis von bereits bekannten, breit neutralisierenden Antikörpern, wurden insgesamt zehn Antikörper, die an unterschiedlichen Epitopen des HIV - Oberflächenproteins binden als scFv, IgG4 und IgG1 Variante generiert, um so die Eigenschaften zu charakterisieren und mit den jeweiligen IgG4 und IgG1 Antikörpern zu vergleichen. Die Antikörperkonstrukte wurden in verschiedenen Assays, sowie in einem nicht-humanisierten Mausmodell getestet. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass alle Einzelstrang-Antikörper lösliches und zell-oberflächen gebundenes Protein binden. In einem Neutralisationsassay wurden höhere Konzentrationen der Einzelstrang-Antikörper benötigt, um eine vergleichbare Neutralisationsaktivität gegen vier verschiedene HIV-1 Pseudoviren zu erreichen. In einem klinisch geprüften Autoreaktivitätstest konnte kein wesentlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Antikörper-Gruppen gezeigt werden. Eine Mutation in der konstanten Domäne der scFv und IgG4 Antikörper konnte die Halbwertszeit nach intravenöser Injektion in nicht-humanisierten Mäusen verlängern im Vergleich zu den jeweiligen IgG1 Antikörpern. Weiterhin 10 wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, um neue Behandlungsansätze in vivo zu testen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die Einzelstrang-Antikörper basierend auf breit neutralisierenden Antikörpern als Bindungsdomäne von CAR-T-Zellen eignen und vielversprechende Eigenschaften bieten, sodass die spezifische Erkennung und Bindung von Zielantigenen ermöglicht wird. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bach, Franziska franziska.bach93@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email Research team member Gruell, Henning UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-748705
Date:	2024
Language:	English
Faculty:	Faculty of Medicine
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HIV-1 English CAR T Cells English
Date of oral exam:	1 October 2024
Referee:	Name Academic Title Klein, Florian Prof. Dr. med. Niessen, Carien Prof. PhD
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/74870