Universität zu Köln

Macha, Arthur ORCID: 0009-0007-1798-4412 (2021). Mechanism of gephyrin dependent inhibitory receptor clustering. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Gephyrin is the major scaffolding protein at inhibitory γ-aminobutyric acid- (GABA) and glycinergic synapses. Neuronal inhibition is essential for the function of the central and peripheral nervous systems by balancing excitatory signals. The formation and maintenance of inhibitory synapses is achieved through the direct interaction of gephyrin and GABA type A receptors (GABAAR) or glycine receptors (GlyR), restricting their lateral movement in the postsynaptic membrane and ensuring a sufficient number of receptors at the synaptic cleft for adequate signal transmission between neurons. In addition, gephyrin exhibits various interactions with other elements of the postsynaptic density, highlighting its key position as a major organizer of inhibitory synapses. Accordingly, the plasticity of glycinergic and GABAergic synapses is highly dependent on the function of gephyrin and, if impeded, can lead to severe neurological disorders. Therefore, detailed studies of gephyrin-mediated receptor clustering processes at the molecular level are crucial for a better understanding of disease-causing mechanisms. The first part of this thesis focuses on the characterization of a patient suffering from developmental and epileptic encephalopathy (DEE) with hypertension and clonic movements caused by bi-allelic mutations in the GPHN gene. The combination of a paternally inherited splice acceptor variant resulting in nonsense-mediated mRNA decay and a maternally inherited missense mutation leading to a D422N variant collectively causing a severe disease course that persists into the patient's childhood and beyond. Characterization of the gephyrin D422N variant revealed reduced protein degradation and decreased receptor binding abilities, impairing the formation of inhibitory synaptic clusters. This case study is an additional example that demonstrates the importance of gephyrin-mediated clustering and how a detailed molecular understanding of disease-causing mechanisms possibly could aid in future therapy development. Up to this point little is known about the precise mechanism of complex formation between gephyrin and inhibitory receptors. Therefore, in the second part, GlyR intracellular domain (ICD) mimicking pentameric proteins based on the lumazine synthase (LS) were used to further investigate the gephyrin-receptor interaction. Through this, it was shown that ICDs in a pentameric organization were saturated by multiple gephyrin molecules in a concentration-dependent manner and that multiple LS were linked by the high- and low-affinity binding sites of gephyrin, thus depicting a novel mechanism of gephyrin mediated GlyR fixation in the postsynaptic membrane In the last part, the established pentameric GlyR-ICD model system was used to gain further insight into the gephyrin-GlyR binding mechanism using single particle electron microscopy analysis. Trimeric gephyrin was shown to undergo ligand-induced conformational changes to allow dimerization of its receptor-binding E-domain, which harbors the high-affinity binding site. Moreover, dimerization potentially occurred within single gephyrin trimer, challenging the formation of synapse spanning gephyrin complexes as proposed in previous studies. These data provide a potential new concept for the mechanism behind the gephyrin-receptor interaction and shed additional light on the explicit molecular processes involved in gephyrin-receptor complex formation at the postsynaptic membrane.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Mechanismus der gephyrin abhängigen Clusterbildung von inhibitorischen Receptoren German
Translated abstract:	Abstract Language Gephyrin ist das dominante Gerüstprotein an inbibitorischen γ-Aminobuttersäure- (GABA) und glyzinergen Synapsen. Neuronale Hemmung ist für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystems von entscheidender Bedeutung, da sie erregenden Signalen entgegenwirkt. Die Bildung und Aufrechterhaltung hemmender Synapsen wird durch die direkte Interaktion von Gephyrin und GABA Typ ARezeptoren (GABAAR) oder Glyzinrezeptoren (GlyR) erreicht, wodurch deren laterale Bewegung in der postsynaptischen Membran eingeschränkt und eine ausreichende Anzahl von Rezeptoren am synaptischen Spalt für eine angemessene Signalübertragung zwischen Neuronen gewährleistet wird. Darüber hinaus weist Gephyrin diverse Wechselwirkungen mit anderen Elementen der postsynaptischen Dichte auf, was seine Schlüsselstellung als Hauptorganisator hemmender Synapsen unterstreicht. Dementsprechend hängt die Plastizität von glyzinergen und GABAergen Synapsen in hohem Maße von der Funktion von Gephyrin ab und kann, wenn sie gestört ist, zu schweren neurologischen Pathologien führen. Daher sind detaillierte Untersuchungen der Gephyrin-Rezeptor Interaktionsprozesse auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung für ein besseres Verständnis von krankheitsverursachenden Mechanismen. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung eines Patienten, der an einer Entwicklungs- und epileptischen Enzephalopathie (DEE) mit Hypertonie und klonischen Bewegungen leidet, für die bi-allelische Mutationen im GPHN Gen verantwortlich gemacht wurden. Die Kombination von einer väterlich vererbten Spleißakzeptorvariante, die einen Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau verursacht, und einer mütterlich vererbten Missense-Mutation D422N verursachen einen schweren Krankheitsverlauf, der bis ins fortgeschrittene Alter des Patienten anhält. Die Charakterisierung der Geph-D422N-Variante ergab eine verringerte Proteinabbaurate und verminderte Rezeptorbindungsfähigkeiten, wodurch die Bildung inhibitorischer synaptischer Cluster beeinträchtigt wurde. Bis zu diesem Zeitpunkt ist nur wenig über den genauen Mechanismus der Komplexbildung zwischen nativen Gephyrin und Rezeptoren bekannt. Deswegen wurden im zweiten Abschnitt das GlyR intrazelluläre Domänen (IZD) nachahmende pentamere Proteine auf basis der Lumazin Synthase (LS) generiert, um die Gephyrin- Rezeptor Interaktion im oligomeren Zustand zu untersuchen. Hierdurch wurde gezeigt, dass pentamere IZDs durch mehrere Gephyrin Moleküle konzentrationsabhängig gesättigt werden und dass mehrere LS durch die hoch- und niedrigaffinen Bindungsstellen von Gephyrin verbunden werden können. Im letzten Abschnitt wurde das etablierte pentamere GlyR-IZD-Modellsystem verwendet, um weitere Erkenntnisse über den Gephyrin-GlyR-Bindungsmechanismus mittels elektronmikroskopischer Einzelpartikelanalyse zu gewinnen. Es konnte gezeigt werden, dass trimeres Gephyrin ligandeninduzierte Konformationsänderungen durchläuft, um eine Dimerisierung seiner rezeptorbindenden E-Domäne zu ermöglichen, welche die hochaffine Bindungsstelle beherbergt. Darüber hinaus fanden diese Dimerisierungen potenziell innerhalb eines Gephyrin Trimers statt, was die in früheren Studien vorgeschlagene Bildung von hexagonalen Gephyrinkomplexen in Frage stellt. Diese Daten liefern ein potenzielles neues Konzept für den Mechanismus hinter der Gephyrin-GlyR-Interaktion und werfen ein zusätzliches Licht auf die molekularen Prozesse, die an der postsynaptischen Membran wirken. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Macha, Arthur amacha1@uni-koeln.de orcid.org/0009-0007-1798-4412 UNSPECIFIED
Corporate Creators:	Universität zu Köln
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-751275
Date:	2021
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Generalities, Science Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Gephyrin, inhibition, synapses English
Date of oral exam:	2 November 2021
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Guenter Professor Baumann, Ulrich Professor
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/75127