Universität zu Köln

Irani, Melika (2025). Non-invasive imaging of neuronal activity using PET. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Measuring neuronal activity in vivo is still a challenging approach, although it might have a huge impact on science and clinical therapy. cfos, an immediate early gene, is expressed in most brain regions in neurons and has low expression at the basal level, but it is activated rapidly in response to various stimuli, including neuronal activity. It is used in science as a marker for evaluating neuronal activation in vivo. However, it hasn’t been yet possible to measure brain cfos activation in vivo. The 18F-FHBG/PET system is extensively used in both science and clinics to measure the expression of Herpes Simplex Virus 1 thymidine kinase (HSV1-TK) in vivo. HSV1-TK is an enzyme that phosphorylates 18F-FHBG to trap it in the cell, and using the PET system, helps to visualize the cells expressing HSV1-TK. When HSV1-TK expression is controlled by the cfos promoter, we are able to indirectly measure cfos in vivo using PET. However, the 18F-FHBG/PET technique has its limitations for measuring HSV1-TK expression in the brain due to the lack of transporters and the presence of the blood-brain barrier (BBB). SLC43A3 is a purine nucleobase transporter reported to work as a transporter for adenosine and guanosine analogs, including 18F- FHBG. In this project, we aimed to develop a non-invasive PET imaging system to assess neuronal activity in vivo using the 18F-FHBG/PET system. To this end, a cfos-BAC was modified such that a FLEx HSV1-TK cDNA together with a PGK promoter-driven SLC43A3 transporter was inserted into the second exon of the cfos gene via CRISPR/CAS9 Red/ET recombination. The linearized cfos-fl-HSV1-TK:PGK-SLC43A3 BAC was used in pronuclear injection experiments to generate founder lines. To identify the best founder line, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were generated and tested in ex vivo experiments. These tests showed that HTNCre activation triggered HSV1-TK expression under cfos control. Thus, founder mice were crossed with Cre deleter mice to activate cfos-HSV1-TK in all cells to investigate our PET system in vivo. However, although HSV1-TK expression was controlled by the cfos promoter, the 18F-FHBG failed to enter the brain since SLC43A3 was not expressed in lectin-positive BBB. To overcome this limitation, several AAVs were constructed with a strong CAG promoter driving SLC43A3 expression. However, this also failed to be su�ciently expressed in the BBB. The inability to express SLC43A3 in the whole brain, especially in endothelial cells of the blood vessels, might be a potential reason why SLC43A3 doesn’t facilitate 18F-FHBG entrance into the brain. However, we also attempted to reproduce the published data regarding ganciclovir (GCV) tritium or 18F-FHBG uptake in SLC43A3-expressing cells. Surprisingly, these experiments revealed that SLC43A3 neither transports 3H-GCV nor 18F- FHBG, indicating that finding a new transporter for 18F-FHBG to facilitate its entry into the brain without damaging the BBB is a precondition for measuring neuronal activity non-invasively in vivo with great precision.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Non-invasive imaging of neuronal activity using PET UNSPECIFIED
Translated abstract:	Abstract Language Die Messung der neuronalen Aktivit ̈at in vivo ist eine Herausforderung, die einen großen Ein- fluss auf die Wissenschaft und klinische Therapie haben ko ̈nnte. cfos, ein unmittelbar fru ̈hes Gen (Immediate Early Gene), wird in Neuronen in den meisten Regionen des Gehirns exprimiert und weist ein niedriges basales Expressionsniveau auf. Die Expression des Gens steigt bei neu- ronaler Aktivita ̈t deutlich an, weshalb es in der Wissenschaft ha ̈ufig als Marker zur Bewertung der neuronalen Aktivierung in vivo verwendet wird. Bisher war es nicht m ̈oglich, die Aktivierung von cfos im Gehirn in vivo zu messen. Das 18F-FHBG/PET-System wird sowohl in der Wis- senschaft als auch in der Klinik umfassend verwendet, um die Expression der Herpes-Simplex- Virus-1-Thymidinkinase (HSV1-TK) in vivo zu messen. HSV1-TK ist ein Enzym, das 18F- FHBG phosphoryliert, wodurch dieses in der Zelle eingeschlossen wird. Mittels PET (Positronen- Emissions-Tomographie) kann die Expression von HSV1-TK detektiert werden. Wenn die HSV1- TK-Expression durch den cfos-Promotor gesteuert wird, kann cfos in vivo indirekt mittels PET gemessen werden. Die 18F-FHBG/PET-Technik hat ihre Grenzen bei der Messung der HSV1- TK-Expression im Gehirn, da kein geeigneter Transporter fu ̈r FHBG in die Blut-Hirn-Schranke (BBB) vorliegt. Es konnte gezeigt werden, dass SLC43A3, ein Purin-Nukleobase-Transporter, 18F-FHBG als Substrat transportiert. Ziel dieses Projektes war es, ein nicht-invasives PET- Bildgebungssystem zu entwickeln, mit dem neuronale Aktivierung im Gehirn untersucht werden kann. Dazu wurde ein cfos-BAC so modifiziert, dass eine FLEx-HSV1-TK-cDNA zusammen mit einem PGK-Promotor-gesteuerten SLC43A3-Transporter in das zweite Exon des cfos-Gens mittels CRISPR/Cas9 Red/ET-Rekombination integriert wurde. Das linearisierte cfos-fl-HSV1- TK:PGK-SLC43A3-BAC wurde fu ̈r pronukleare Injektionen verwendet, um Gru ̈nderlinien zu erzeugen. Um die beste Gru ̈nderlinie zu identifizieren, wurden embryonale Fibroblasten von Ma ̈usen (MEFs) generiert und ex vivo analysiert. Diese Ergebnisse zeigten, dass durch HTNCre- Aktivierung die HSV1-TK-Expression unter der Kontrolle des cfos-Promotors induziert werden konnte. Die Gru ̈nderlinien wurden daher mit Cre-Deleter-Ma ̈usen gekreuzt, um cfos HSV1-TK in allen Zellen zu aktivieren und unser PET-System in vivo zu untersuchen. Obwohl die HSV1- TK-Expression durch den cfos-Promotor gesteuert wurde, konnte 18F-FHBG nicht in das Gehirn gelangen, da SLC43A3 nicht in Lectin-positiven Endothelzellen der BBB exprimiert wurde. Zur U ̈berwindung dieser Limitierung wurden mehrere AAVs mit einem starken CAG-Promotor zur Expression von SLC43A3 konstruiert. Auch dies fu ̈hrte jedoch nicht zu einer ausreichenden Expression in der BBB. Die Tatsache, dass SLC43A3 nicht in den Endothelzellen der BBB ex- primiert werden konnte, k ̈onnte ein mo ̈glicher Grund dafu ̈r sein, dass 18F-FHBG nicht in das Gehirn transportiert wird. Beim Versuch, die von Furukawa et al. (2016) publizierten Daten zu reproduzieren, konnte gezeigt werden, dass SLC43A3 weder GCV noch 18F-FHBG transportiert. Dies zeigt, dass die Suche nach einem neuen Transporter fu ̈r 18F-FHBG, der dessen Eintritt in das Gehirn erm ̈oglicht, ohne die BBB zu sch ̈adigen, eine wesentliche Voraussetzung ist, um neuronale Aktivita ̈t in vivo nicht-invasiv messen zu ko ̈nnen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Irani, Melika melika.irani1994@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
Contributors:	Contribution Name Email UNSPECIFIED Wunderlich, Thomas thomas.wunderlich@sf.mpg.de UNSPECIFIED Backes, Heiko backes@sf.mpg.de
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-752574
Date:	2025
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Metabolism Research
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language UNSPECIFIED English
Date of oral exam:	10 February 2025
Referee:	Name Academic Title Wunderlich, Thomas Professor
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/75257