Universität zu Köln

Ozer Yildiz, Ebru ORCID: 0000-0002-7832-3964 (2025). AAK1 Regulates Microtubule-Dependent Autophagosome Transport by Controlling MARK2 Phosphorylation in Neurons. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Clathrin-mediated endocytosis (CME) is one of the most essential endocytic pathways in eukaryotic cells, playing a crucial role in the uptake of nutrients and substances such as low density lipoprotein receptor (LDLR) and transferrin receptor (TfnR). In neurons, which are highly polarized, non-mitotic, and possess long axons and dendrites that extend far from the cell soma, CME is of paramount importance. It plays a pivotal role in synaptic vesicle recycling, ensuring the continuity of synaptic function and plasma membrane (PM) renewal, which is vital for neuronal health. Adaptor-associated kinase 1 (AAK1) was originally discovered as a kinase that phosphorylates the adaptor protein complex-2 (AP-2), enhancing its affinity for the PM and facilitating the maturation of endocytic pits. Recent studies have uncovered versatile roles for AAK1 beyond its canonical role in CME, including potential roles in neurodegeneration and autophagy regulation. Our study aimed to elucidate the role of AAK1 in the brain in vivo, utilizing both global and conditional knockout (cKO) mouse models of AAK1. Strikingly, these models demonstrated similar phenotypes, including reduced body weight, hyperactivity in open field tests, and impaired motor behavior during beam walk assays. These findings strongly indicate a neuron-specific role for AAK1 that is critical for maintaining neuronal function and health. To understand the molecular basis of these phenotypes, we employed a "narrowing down" approach, starting from the whole brain and moving down to synaptosomes, combined with biochemical, proteomic, and imaging techniques. Our data revealed that AAK1 plays an essential role in the regulation of microtubule-associated protein kinase-2 (MARK2) in the brain. Interestingly, AAK1 expression in wildtype (WT) cortices peaks at around 12 weeks of age, coinciding with the peak period of synaptic refinement and plasticity. This temporal pattern aligns with the observed increase in ATG9A expression in AAK1 knockout (KO) mice at 12 weeks, suggesting that AAK1 may play a role in maintaining autophagy homeostasis during this critical developmental window. Indeed, the loss of AAK1 led to dysregulated autophagy, as reflected by an increased number of autophagosomes and a decrease in synaptic vesicles within synapses, indicating impaired autophagosome trafficking. The dysregulation of MARK2 localization due to AAK1 depletion also affected microtubule dynamics, synaptic physiology, and vesicular trafficking. This was reflected by altered microtubule post-translational modifications. These changes ultimately led to an accumulation of autophagosomes in synapses, impaired autophagic flux, and reduced synaptic vesicle availability, further implicating AAK1 as a critical regulator of autophagosome trafficking and synaptic health. Taken together, these findings demonstrate that AAK1 is a key regulator of neuronal function, linking autophagosome trafficking and microtubule dynamics through the modulation of MARK2 particularly during critical windows of synaptic plasticity and maturation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die clathrin-vermittelte Endozytose (CME) ist einer der wichtigsten endozytotischen Wege in eukaryotischen Zellen und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen und Substanzen wie dem LDL-Rezeptor (low-density lipoprotein receptor, LDLR) und dem Transferrin-Rezeptor (TfnR). Bei Neuronen, die hochpolarisiert, nicht-mitotisch und mit langen Axonen und Dendriten weit vom Zellkörper entfernt sind, ist CME von größter Bedeutung. CME spielt eine zentrale Rolle beim Recycling von synaptischen Vesikeln und gewährleistet die Kontinuität der synaptischen Funktion sowie die Erneuerung der Plasmamembran (PM), was für die neuronale Gesundheit von entscheidender Bedeutung ist. Die Adaptor-assoziierte Kinase 1 (AAK1) wurde ursprünglich als Kinase entdeckt, die den Adaptor-Protein-Komplex 2 (AP2) phosphoryliert, wodurch dessen Affinität zur PM erhöht und die Reifung der endozytotischen Vesikel gefördert wird. Neuere Studien haben gezeigt, dass AAK1 über ihre kanonische Rolle in der CME hinaus vielseitige Funktionen hat und möglicherweise eine Rolle bei der Neurodegeneration und der Regulation der Autophagie spielt. Unsere Studie zielte darauf ab, die Rolle von AAK1 im Gehirn in vivo zu untersuchen, wobei sowohl globale als auch konditionale Knockout (cKO) Mausmodelle von AAK1 verwendet wurden. Diese Modelle zeigten auffallend ähnliche Phänotypen, darunter reduziertes Körpergewicht, Hyperaktivität und beeinträchtigte motorische Fähigkeiten im Beam-Walk-Test. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass AAK1 eine neuronenspezifische Rolle spielt, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion und Gesundheit ist. Um die molekularen Grundlagen dieser Phänotypen zu verstehen, haben wir einen „Narrowing-Down“-Ansatz verwendet, der vom gesamten Gehirn bis hin zu synaptischen Kompartimenten (Synaptosomen) reicht und mit biochemischen, proteomischen und bildgebenden Techniken kombiniert wurde. Unsere Daten zeigten, dass AAK1 eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Mikrotubuli-assoziierten Proteinkinase 2 (MARK2) spielt, einem neuartigen Substrat im Gehirn. Interessanterweise erreicht die AAK1-Expression in Wildtyp-Kortexen (WT) ihren Höhepunkt etwa im Alter von 12 Wochen, was mit der Spitzenphase der synaptischen Verfeinerung und Plastizität übereinstimmt. Dieses zeitliche Muster stimmt mit dem beobachteten Anstieg der ATG9A-Expression in AAK1-Knockout-Mäusen (KO) im Alter von 12 Wochen überein, was darauf hindeutet, dass AAK1 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Autophagie-Homöostase während dieses kritischen Entwicklungszeitfensters spielen könnte. Tatsächlich führte der Verlust von AAK1 zu einer dysregulierten Autophagie, was sich durch eine erhöhte Anzahl von Autophagosomen und eine verringerte Anzahl von synaptischen Vesikeln in Synapsen widerspiegelte, was auf eine beeinträchtigte Autophagosomen-Trafficking hinweist. Die Dysregulation der MARK2-Lokalisation aufgrund des AAK1-Mangels beeinträchtigte ebenfalls 11 die Mikrotubuli-Dynamik, die synaptische Physiologie und den vesikulären Transport. Dies spiegelte sich in veränderten posttranslationalen Modifikationen von Mikrotubuli wider. Diese Veränderungen führten letztendlich zur Akkumulation von Autophagosomen in Synapsen, einer beeinträchtigten Autophagie-Flussrate und einer reduzierten Verfügbarkeit von synaptischen Vesikeln, was AAK1 als kritischen Regulator des Autophagosomen-Traffickings und der synaptischen Gesundheit weiter impliziert. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass AAK1 ein wichtiger Regulator der neuronalen Funktion ist, der das Autophagosomen-Trafficking und die Mikrotubuli-Dynamik durch die Modulation von MARK2 insbesondere während kritischer Phasen der synaptischen Plastizität und Reifung miteinander verknüpft. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ozer Yildiz, Ebru ebru.yildiz@uk.koeln.de orcid.org/0000-0002-7832-3964 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-753555
Date:	2025
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CECAD - Cluster of Excellence Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Endocytosis, AAK1, clathrin, autophagy, neuron, microtubules English
Date of oral exam:	6 February 2025
Referee:	Name Academic Title Kononenko, Natalia Prof. Dr. Krüger, Marcus Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/75355