Universität zu Köln

Heuten, Elena Lara (2025). Investigation of PINK1 cleavage and trafficking using novel PARL-targeted α-ketoamide-based inhibitors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mitochondrial quality control is a critical component of cellular homeostasis. The serine/threonine kinase PINK1 plays a pivotal role in maintaining a healthy pool of mitochondria. Under normal conditions, PINK1 is imported into intact polarized mitochondria, where it is cleaved by the inner mitochondrial rhomboid protease PARL and subsequently rapidly degraded via the proteasome. However, under circumstances such as depolarized mitochondria, uncleaved PINK1 accumulates at the outer mitochondrial membrane, initiating PINK1-Parkin-mediated mitophagy to remove the damaged organelle. Despite PINK1’s importance, many aspects regarding the regulation of PARL activity, PINK1 cleavage and localization under physiological conditions remain unclear. A major challenge in investigating these processes is the reliance on depolarizing agents or time-consuming PARL knockdowns or knockouts, which bear the risk of masking other mitochondrial pathways and mechanisms. Specific PARL inhibitors, which would mitigate these problems, are so far lacking. In this thesis, I establish a novel PARL-targeted group of α-ketoamide-based inhibitors by validating them using two PARL substrates, PGAM5 and PINK1, in human cell models. I demonstrate that these inhibitors exhibit high potency, do not disrupt the mitochondrial membrane potential, and are largely non-toxic at appropriate concentrations, making them well-suited for future research applications. Furthermore, I show that PARL inhibition results in alternative PINK1 cleavage fates and different submitochondrial localizations, leading also to PINK1 accumulation at the outer mitochondrial membrane and causing Parkin recruitment, a hallmark of mitophagy. Notably, I reveal PARL inhibition as a novel trigger for OMA1-mediated cleavage of PINK1 and uncover the interactions between PINK1 and the TOM and TIM23 import complexes upon PARL inhibition. Taken together, these inhibitors open up new investigative strategies for advancing PARL research. My establishment and application of the novel PARL inhibitors has illuminated PINK1 processing and its downstream pathways, highlighting PARL as a dynamic regulator of mitochondrial homeostasis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondriale Qualitätskontrolle ist eine entscheidende Komponente der zellulären Homöostase. Die Serin/Threonin-Kinase PINK1 spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der angemessenen Anzahl gesunder Mitochondrien. Unter normalen Bedingungen wird PINK1 in polarisierte, intakte Mitochondrien importiert, wo es durch die innere mitochondriale Rhomboidprotease PARL gespalten und anschließend im Zytosol rasch durch das Proteasom abgebaut wird. Bei depolarisierten Mitochondrien hingegen akkumuliert ungespaltenes PINK1 an der äußeren Mitochondrienmembran und initiiert PINK1-Parkin-Mitophagie, um die beschädigten Organellen zu entfernen. Trotz der Bedeutung von PINK1 sind viele Aspekte der Regulation von PARL-Aktivität, PINK1-Spaltung und -Lokalisation unter physiologischen Bedingungen weiterhin unklar. Eine wesentliche Herausforderung bei der Untersuchung dieser Prozesse besteht in der Abhängigkeit von depolarisierenden Substanzen oder zeitaufwändigen PARL-Knockdowns oder -Knockouts, die das Risiko beinhalten, andere mitochondriale Signalwege und Mechanismen zu verdecken. Spezifische PARL-Inhibitoren, die diese Probleme beheben könnten, fehlen bisher. In dieser Arbeit stelle ich eine neue Gruppe von PARL-spezifischen, auf α-Ketoamid basierenden Inhibitoren vor, die ich mithilfe zweier PARL-Substrate, PGAM5 und PINK1, in humanen Zellmodellen validiere. Ich weise nach, dass diese Inhibitoren eine hohe Wirksamkeit besitzen, dass sie das mitochondriale Membranpotential nicht zerstören und dass sie bei effektiven Konzentrationen größtenteils nicht toxisch für die Zellen sind, was sie für zukünftige Forschungsanwendungen ideal macht. Darüber hinaus zeige ich, dass die Inhibition von PARL zu alternativen PINK1 Spaltungswegen und unterschiedlichen submitochondrialen Lokalisationen führt, einschließlich der Akkumulation von PINK1 an der äußeren Mitochondrienmembran, was die Rekrutierung von Parkin – ein Kennzeichen der Mitophagie – auslöst. Insbesondere identifiziere ich die PARL-Inhibition als neuartigen Auslöser für die OMA1-vermittelte Proteolyse von PINK1 und decke Interaktionen zwischen PINK1 und den Importkomplexen TOM und TIM23 unter PARL-Inhibition auf. Zusammenfassend eröffnen diese Inhibitoren neue Möglichkeiten für die PARL Forschung. Meine Etablierung und Anwendung der neuartigen PARL-Inhibitoren beleuchtet die Wege der PINK1-Prozessierung und deren nachgeschalteten Signalwege und hebt PARL als dynamischen Regulator der mitochondrialen Homöostase hervor. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Heuten, Elena Lara eheuten@arcor.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-754130
Date:	2025
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Zentrum für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language rhomboid UNSPECIFIED protease UNSPECIFIED intramembrane protease UNSPECIFIED PARL UNSPECIFIED PINK1 UNSPECIFIED inhibitor UNSPECIFIED proteolysis UNSPECIFIED mitochondria UNSPECIFIED
Date of oral exam:	11 March 2025
Referee:	Name Academic Title Lemberg, Marius Prof. Dr. Kononenko, Natalia Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/75413