Universität zu Köln

Schlegel, Tim ORCID: 0009-0001-6255-723X (2025). Mitochondrial proteome maintenance in murine spinal motor axons and the role of the RNA-binding protein CLUH. PhD thesis, Universität zu Köln.

PDF Thesis_For Publishing_.pdf Bereitstellung unter der CC-Lizenz: Creative Commons Attribution. Download (10MB)

Abstract

Mitochondria play a very important role in mediating neuronal activity and survival. Dysfunction of mitochondria is related to a variety of neurodegenerative diseases. Often axons are particularly affected, which is thought to be connected to the high polarisation of neurons. Their long axons and other distal areas make the homeostasis of organelles like mitochondria and the supply of new proteins challenging. Direct transport of proteins or whole organelles over long distances can be limited by protein half-live. Thus, transport of mRNAs and local translation are central alternatives. RNA binding proteins (RBPs) play an important role in this context, by forming complexes that can regulate mRNA stability, transport and translation, and mediate the tethering of mRNAs to organelles to facilitate localised translation. CLUH (Clustered mitochondria protein homolog) is an RBP, which binds to mRNAs of nuclear-encoded mitochondrial proteins. Loss of CLUH not only leads to clustering of mitochondria, but also to an increased decay of its target mRNAs and to a reduced abundance of the corresponding proteins. This defect has also been observed in axons of primary spinal motoneurons of a Cluh knock-out mouse model. Thus, suggesting a key role of CLUH in regulating mitochondrial biogenesis at post-transcriptional level. As mentioned, mitochondria in axons face the challenge of long distances for the maintenance with new proteins and it is unclear what affects this may have on the mitochondrial proteome. Therefore, I wanted to compare the mitochondria annotated proteome of axons to the rest of the cell. I cultured primary spinal motoneurons in a two-chambered microfluidic device, yielding one compartment composed exclusively of axons and another with whole neurons. Analysis of the axonal mitochondrial proteome identified the depletion of proteins involved into oxidative phosphorylation and parts of the citric acid cycle, while proteins involved in fatty acid metabolism and urea cycle were enriched in axons. These proteome changes suggest a metabolic difference between axonal and whole cell mitochondria. By correlating my data to other existing datasets, I explored if mRNA stability, mRNA transport, axonal translatome or protein half-life could be factors involved in regulating protein enrichment. While no factor correlated with the mitochondrial proteome in general, protein half-life appeared to play a substantial role in the citric acid cycle. Moreover, the shift from elongated to circular morphology of axonal mitochondria, correlated with an increase of soluble over membrane associated mitochondrial proteins in axons. In a more specific approach, focusing on the RBP CLUH, I investigated how CLUH may regulate its mRNA targets on a post-transcriptional level in motoneurons. In order to analyse whether the reduced mRNA abundance in axons of primary spinal motoneurons may be caused by altered axonal transport, I used an optimised mRNA-tether system (MS2-MCP) that allows for live imaging of mRNA at high temporal and spatial resolution. I showed that CLUH has no effect on active and directed transport of target mRNAs (Mdh2, Atp5a), suggesting that other regulatory mechanisms like increased mRNA decay are involved in the lower mRNA levels. Increased decay could be due to mislocalisation of mRNA away from translational hubs like endosomal and mitochondrial surfaces. However, I found only a small reduction in association length and no change in co-movement of Mdh2 mRNA with late endosomes in CLUH KO axons. Similarly, in HeLa cells CLUH did not impact co-localisation of mRNA to late endosomes or mitochondria and CLUH preferentially associates with Mdh2 away from these organelles.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondrien spielen eine sehr wichtige Rolle für die neuronale Aktivität und die Aufrechterhaltung von Neuronen. Eine Funktionsstörung der Mitochondrien steht in Zusammenhang mit einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen. Häufig sind die Axone besonders betroffen, was vermutlich mit der starken Polarisierung der Neuronen zusammenhängt. Die langen Axone und andere distale Bereiche, machen die Aufrechterhaltung von Organellen wie Mitochondrien und die Versorgung mit neuen Proteinen zu einer Herausforderung. Der direkte Transport von Proteinen oder ganzen Organellen über große Entfernungen kann durch die Halbwertszeit von Proteinen begrenzt sein. Daher sind der Transport von mRNAs und die lokale Translation zentrale Alternativen. RNA-bindende Proteine (RBPs) spielen in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle, indem sie Komplexe bilden, die die Stabilität, den Transport und die Translation von mRNAs regulieren können und die Verankerung von mRNAs an Organellen vermitteln, um eine lokalisierte Translation zu erleichtern. CLUH (Clustered mitochondria protein homolog) ist ein RBP, das an mRNAs von Nukleus kodierten mitochondrialen Proteinen bindet. Der Verlust von CLUH führt nicht nur zu einer Haufenbildung der Mitochondrien, sondern auch zu einem verstärkten Abbau der mRNAs die CLUH bindet und zu einer reduzierten Häufigkeit der entsprechenden Proteine. Dieser Defekt wurde auch in Axonen primärer spinaler Motoneuronen eines Cluh-Knockout-Mausmodells beobachtet. Dies deutet auf eine Schlüsselrolle von CLUH bei der Regulierung der mitochondrialen Biogenese auf post-transkriptioneller Ebene hin. Wie bereits erwähnt, sind die Mitochondrien in den Axonen mit der besonderen Herausforderung konfrontiert, dass sie über längere Strecken mit neuen Proteinen versorgt werden müssen, und es ist unklar, welche Auswirkungen dies auf ihr Proteom hat. Daher wollte ich das mitochondrial annotierte Proteom von Axonen mit dem Rest der Zelle vergleichen. Ich kultivierte primäre spinale Motoneuronen in einem zweikammerigen mikrofluidischen System, in dem eine Seite ausschließlich aus Axonen bestehendes und die andere die ganzen Neuronen enthält. Die Analyse des axonalen mitochondrialen Proteoms ergab, dass Proteine, die an der oxidativen Phosphorylierung und an Teilen des Zitronensäurezyklus beteiligt sind, in den Axonen unterrepräsentiert sind, während Proteine, die am Fettsäurestoffwechsel und am Harnstoffzyklus beteiligt sind, in den Axonen angereichert sind. Diese Veränderungen des Proteoms deuten auf einen Unterschied im Stoffwechsel zwischen axonalen und anderweitigen Mitochondrien hin. Durch Korrelation meiner Daten mit anderen bestehenden Datensätzen untersuchte ich, ob der mRNA-Transport, das axonale Translatom oder die Protein-Halbwertszeit Faktoren sein könnten, die die Proteinverteilung regulieren. Während kein Faktor mit dem mitochondrialen Proteom im Allgemeinen korrelierte, schien die Protein-Halbwertszeit eine wesentliche Rolle im Zitronensäurezyklus zu spielen. Darüber hinaus korrelierte der Übergang von einer länglichen zu einer kreisförmigen Morphologie der axonalen Mitochondrien mit einer Zunahme der löslichen gegenüber den membranassoziierten mitochondrialen Proteinen in den Axonen. In einem spezifischeren Ansatz, der sich auf das RBP CLUH konzentrierte, untersuchte ich, wie CLUH seine mRNA-Ziele auf post-transkriptioneller Ebene in Motoneuronen regulieren kann. Um zu analysieren, ob die verringerte mRNA-Häufigkeit in Axonen primärer spinaler Motoneuronen durch einen veränderten axonalen Transport verursacht werden könnte, verwendete ich ein optimiertes mRNA-Adaptersystem (MS2-MCP), dass eine Live-Bildgebung von mRNA mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Ich konnte zeigen, dass CLUH keine Auswirkungen auf den aktiven und gerichteten Transport von Ziel-mRNAs (Mdh2, Atp5a) hat, was darauf hindeutet, dass andere Regulationsmechanismen wie ein erhöhter mRNA-Abbau für das niedrigere mRNA-Level verantwortlich sind. Der verstärkte Abbau könnte auf eine Fehllokalisierung der mRNA weg von Translationszentren wie endosomalen und mitochondrialen Oberflächen zurückzuführen sein. Ich fand jedoch nur eine geringe Verringerung der Assoziationsdauer und keine Veränderung der gemeinsamen Bewegung von Mdh2 mRNA mit späten Endosomen in CLUH-KO-Axonen. Auch in HeLa-Zellen hatte CLUH keinen Einfluss auf die Kolokalisation von mRNA mit späten Endosomen oder Mitochondrien, und CLUH assoziiert bevorzugt mit Mdh2 abseits dieser Organellen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schlegel, Tim tim.schlegel2@gmail.com orcid.org/0009-0001-6255-723X UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-780854
Date:	2025
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CECAD - Cluster of Excellence Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Mitochondria English Axonal proteome English RNA binding protein English CLUH English Axonal transport English mRNA localisation English Urea cycle English Citric acid cycle English
Date of oral exam:	5 February 2025
Referee:	Name Academic Title Rugarli, Elena Irene Prof. Dr. Gehring, Niels Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/78085