Beeinflussung der heterotetrameren Struktur der anti-apoptotischen Proteinkinase CK2 als potentielle pharmakologische Strategie

Steinkrüger, Michaela (2016). Beeinflussung der heterotetrameren Struktur der anti-apoptotischen Proteinkinase CK2 als potentielle pharmakologische Strategie. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Die Proteinkinase CK2 ist eine hochkonservierte Serin-/Threoninkinase, welche ubiquitär exprimiert wird und gehört zur CMGC-Familie der eukaryotischen Proteinkinasen (ePKs). Bei der CK2 handelt es sich um einen heterotetrameren Komplex, welcher aus einem Dimer zweier regulatorischer Untereinheiten (CK2β) besteht, an welches sich je eine katalytische Untereinheit (CK2α) anlagert. Die CK2α-Untereinheit ist konstitutiv aktiv, auch ohne die Assoziation mit CK2β und es sind bis heute keine sekundären Modifikation für die in vivo Regulierung der CK2-Aktivität bekannt. Die Assoziation mit CK2β sorgt jedoch für eine Veränderung der Substratspezifität sowie eine Erhöhung der Thermostabilität und Aktivität. Weiterhin ist die CK2 pleiotrop und hat ein breites Substratspektrum mit bis jetzt mehr als 300 bekannten Substraten. Aufgrund der Pleiotropie ist bis heute noch keine genaue Einordnung der CK2 in die bisher bekannten Signaltransduktionsnetzwerke erfolgt. Bekannt ist jedoch, dass sie in vielen fundamentalen Zellprozessen involviert ist. Hierzu zählen die Regulierung des Zellzykluses, des zirkadianen Rhythmuses, der Genexpression, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, der Embryogenese sowie der Apoptose (wobei CK2 anti-apoptotisch wirkt). Die CK2 steht im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, entzündlichen und vaskulären Erkrankungen, sowie Erkrankungen der Skelettmuskulatur und des Knochengewebes. Vor allem aber steht die Überexpression in einer Vielzahl von Tumoren im Fokus, welche die CK2 zu einer wichtigen Zielstruktur für die Krebstherapie zur Entwicklung kleiner Moleküle zur Inhibition der Aktivität macht. Für die Entwicklung von Inhibitoren bietet die CK2 mehrere Angriffspunkte, welche zum einen gegen das Holoenzym und zum anderen gegen die beiden Untereinheiten gerichtet sind. Für die CK2α zählen hierzu Inhibitoren, welche die ATP- oder Substratbindungsstelle angreifen sowie allosterische Inhibitoren. Die CK2β-Untereinheit ist für die Rekrutierung von einigen Substraten notwendig und dies kann als Angriffspunkt für die Entwicklung von Inhibitoren, die an der Rekrutierungsstelle binden, genutzt werden. Das CK2-Holoenzym bietet als Angriffspunkt für Inhibitoren die CK2α/CK2β-Interaktion. Diese kann durch kleine organische Moleküle sowie Peptide gestört werden. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich nach solchen Molekülen gesucht, welche die CK2α/CK2β-Interaktion negativ beeinflussen. Für die Identifikation von neuen Inhibitoren wurde ein Fluoreszenz-Anisotropie (FA)-Assay sowie Microscale Thermophorese (MST)-Messungen herangezogen. Validiert wurden die hier erhobenen Ergebnisse mit bereits unternommen kalorimetrischen Untersuchungen. Zunächst wurden dafür Dissoziationskonstanten KD mit dem jeweiligen Interaktionspartner ermittelt. Im FA-Assay wurde hierfür das CK2β-nachahmende zyklische Peptid Pc mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und als Interaktionspartner für die CK2α verwendet. Für das zyklische Peptid Pc konnte bereits sowohl mit einem radiometrischen Assay, als auch strukturbiologisch die Interaktion mit CK2α aufgeklärt werden. Für die MST Messungen wurde die CK2 direkt fluoreszenzmarkiert. Beide Methoden lieferten dabei ähnliche Ergebnisse wie bereits in der Literatur beschrieben, auch für die Interaktion von CK2β mit der paralogen CK2α‘. Mittels der beiden Assays konnten neue Derivate des zyklischen Peptids Pc als potente Inhibitoren der CK2α/CK2β-Interaktion identifiziert werden. Weiterhin konnten durch die MST Messungen die Werte für den aus der Literatur bekannten Inhibitor W16 reproduziert und Derivate von diesem als Inhibitoren identifiziert werden. Eine weitere interessante Beobachtung konnte mit Substanzen vom Indeno[1,2-b]indol-Typs bei den MST-Messungen gemacht werden. Diese sind eigentlich als ATP-kompetitive Inhibitoren der CK2α bekannt. Während drei der Substanzen vom Indeno[1,2-b]indol-Typ einen inhibitorischen Effekt auf die CK2α/CK2β-Interaktion hatten, zeigten die restlichen Substanzen eine Verstärkung der Affinität zwischen CK2α und CK2β. Die vorliegende Arbeit beschreibt weiterhin die Etablierung eines eukaryotisches Überexpressionsystems für die CK2-Untereinheiten, bei welchem die Proteine in den Zellkulturüberstand sekretiert und mittels eines fusionierten doppel-Streptag-II gereinigt werden. Durch die Transfektion von HEK293-EBNA-Zellen konnte eine gesteigerte Proliferation für CK2α und für eine CK2α-Mutante beobachtet werden. Zellen, die mit einer CK2β-Mutante transfiziert worden waren, zeigten ein gehemmtes Wachstum, ähnlich wie bereits bei der Hefe S. Pombe und bei der Überexpression in chinesischen Hamster Ovarienzellen (CHO-Zellen) und in 3T3 L1 Zellen (Murine Fibroblasten) gezeigt wurde. Es konnten CK2α, CK2α1-335, CK2α’C336S sowie CK2β1-193 aus dem Zellkulturüberstand der HEK293-EBNA-Zellen gereinigt und isoliert werden. Für die katalytischen CK2-Untereinheiten konnten Bindungsaffinitäten mit hsCK2β1-193 aus E. coli mit dem neu entwickelten MST-Assay ermittelt werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Protein kinase CK2 is a highly conserved serine/threonine-kinase with ubiquitous expression. This kinase belongs to the family of CMGC kinases of the eukaryotic protein kinases. CK2 is a heterotetrameric complex, which consists of a dimer of two regulatory subunits (CK2β). Each of those regulatory subunits has a catalytic subunit (CK2α) attached to it. The CK2α subunit is constitutively active even without association to the CK2β subunit. To date, there are no secondary modifications for in vivo regulation of CK2 activity known. However, the association with CK2β induces changes in the substrate specificity as well as enhances the thermostability and activity. Furthermore, CK2 is a pleiotropic protein kinase with a broad substrate spectrum. To date, there are more than 300 substrates known. Due to its pleiotropy a possible integration into cellular signaling pathways and regulatory networks has been difficult. However, it is known that CK2 plays a role in a variety of fundamental cellular processes, i.e. the regulation of the cell cycle, the circadian rhythm, gene expression, cell growth and differentiation, embryogenesis and apoptosis with anti-apoptotic effects being ascribed to it. CK2 is associated with a vast amount of human diseases like Alzheimer and Parkinson as well as vascular diseases and diseases of the skeletal muscles and bone tissue. However, most attention has been focused on CK2’s overexpression in a vast variety of human tumors, thus, making CK2 a relevant target for the development of small molecules for the inhibition if its activity as anti-cancer agents. CK2 offers several target sites for the development of new inhibitors. On the one hand, inhibitors may target the holoenzyme and on the other hand they may be directed against one of the two subunits. To date, inhibitors interacting with the ATP-binding or the substrate-binding site of the CK2α subunit are known. However, the possibility of an allosteric inhibition targeting the CK2α subunit has not been explored extensively. The CK2β subunit is necessary for the recruitment of several substrates. There is a binding site at the N-terminal domain of CK2β which is feasible for the development of new inhibitors. Therefore, targeting the CK2α/CK2β-interaction site of the CK2 holoenzyme represents a new approach to inhibition of CK2Currently, there are some small organic molecules as well as peptides known which interrupt this interaction. The presented work focuses mainly on molecules interrupting the CK2α/CK2β-interaction. In order to identify potential inhibitors, fluorescence anisotropy (FA) assays as well as Microscale Thermophorese measurements were used as methods of choice. The here ascertained results of both methods were validated by already performed Isothermal Titration calorimetry measurements. Initially, the dissociation constants KD were determined with the respective interaction partner. A fluorescence labeled version of the CK2β-mimicking cyclic peptide PC was used for the FA assay. This peptide has already been identified to be CK2β competitive by a radiometric assay as well as with crystallographic methods. For MST measurements the CK2β-subunit was labeled directly with a fluorescent dye. The results for the obtained KD values were in good agreement with literature data and could also be confirmed for the paralogous CK2α’. Applying both methods, new derivatives of the cyclic peptide Pc could be identified as potent inhibitors of the CK2α/CK2β-interaction. Furthermore, literature data for the chemical inhibitor W16 could be reproduced via MST. Moreover, derivatives of W16 were identified as new inhibitors. Interestingly, the substances of the indeno[1,2-b]indol-type that has been identified as an inhibitor of the CK2α/CK2β-interaction by means of MST measurements is also known to be an ATP-competitive inhibitor. Strikingly, only three compounds have shown to interfere with the CK2α/CK2β-interaction while the other substances exhibited an intensification of the affinity of the two subunits. Furthermore, the presented work includes the establishment of a eukaryotic overexpression system for the CK2 subunits. Utilizing this system, the proteins were secreted into the cell culture supernatant and purified by a fused double Streptag II. HEK293-EBNA cells transfected with either CK2α full-length or a C-terminal deletion mutant of CK2α showed an increased proliferation. In contrast, cells transfected with a C-terminal deletion mutant of CK2β exhibited a decreased growth. Similar effects were observed for overexpression in yeast (S. Pombe), Chinese hamster ovary cells (CHO-cells) and 3T3 L1 cells (murine fibroblasts). Successful purification and isolation from HEK293-EBNA cell supernatant was achieved for the subunits CK2α1-335, CK2α’C336S as well as CK2β1-193. For the catalytic subunits the determination of binding affinities with hsCK2β1-193 from E. coli with the new MST assay was possible.

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