Local adaptation of Daphnia magna to protease inhibitors in cyanobacteria – The characterization of the serine protease CT448

Lange, Jacqueline ORCID: 0000-0002-9466-4208 (2025). Local adaptation of Daphnia magna to protease inhibitors in cyanobacteria – The characterization of the serine protease CT448. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Cyanobacteria are aquatic photoautotrophic organisms that proliferate in masses, so called blooms, under favorable conditions. Cyanobacterial blooms have increased in freshwater ecosystems due to a combination of eutrophication of waterbodies, rising temperatures and high levels of CO2 with predicted increases in frequency along with a prevalence of potentially toxin-producing cyanobacteria. Many cyanobacterial genera produce toxic secondary metabolites and have been documented as harmful for humans and livestock when they are exposed to water with high concentrations of cyanobacteria. Moreover, cyanobacteria are known to negatively impact the fitness and somatic growth and increase the mortality of the freshwater Cladocera Daphnia sp., an important linker between primary producers and higher trophic levels. During blooms cyanobacteria represent a large proportion of the phytoplankton and thus provide the primary food source for the non-selective filter-feeding Daphnia. The negative effects of toxic canobacteria can be partially attributed to protease inhibitors (PIs), secondary metabolites that disrupt digestive proteases when ingested and are frequently found in surface blooms of cyanobacteria. Daphnia’s tolerance has been demonstrated to increase to toxic cyanobacteria through coexistence over time and space, which is referred to as local adaptation. A recent study demonstrated that positive selection at specific gene loci encoding for digestive proteases drove the evolutionary adaptation of a Swedish Daphnia magna population to cyanobacteria. The persistence of cyanobacterial blooms is a major challenge for lake management and requires multifactorial approaches. One potential approach would be the identification of Daphnia with increased tolerance to protease inhibitors produced by cyanobacteria, as these adapted Daphnia could be used to suppress and control toxic cyanobacterial blooms. Understanding the molecular basis of such local adaptation could offer insights into how proteases are mechanistically inhibited by secondary metabolites of cyanobacteria. The aim of this dissertation is to elucidate changes on the protein level that explain tolerance of a Daphnia magna population to cyanobacterial protease inhibitors of a co-occurring Microcystis strain. Although some progress has been made in understanding the adaptation of Daphnia to cyanobacterial protease inhibitors, further data are required to gain a more comprehensive understanding. In order to examine the mechanisms that contribute to the increased tolerance of a Swedish D. magna population to cyanobacterial protease inhibitors, a susceptible Polish population was chosen for comparison. I expressed the digestive serine protease CT448 from D. magna, which has been previously demonstrated to have undergone positive selection, in Sf21 insect cells. Subsequently, the purified precursor of this protease could be activated through tryptic digestion. This work represents the first successful expression of an active serine protease from crustaceans that function in the gut of Daphnia. Proteomic analysis identified the substrate specificity and revealed that CT448 is a chymotrypsin-like elastase, contrary to previous publications. This study also demonstrated that CT448 is a target of cyanobacterial inhibitors. The studies of the chymotrypsin-like elastase CT448 were focused on investigating the structural properties using the machine learning tool AlphaFold 3. A primary objective was to gain insight into the structural characteristics of CT448, which exhibits a distinctive amino acid substitution at position 34 between the two D. magna populations that were the subject of this study. The predicted structure of CT448 indicates that the pro-peptide could play a role in the functioning of the protease and that the population-specific amino acid of the Swedish population at position 34 may contribute to the stability of CT448 through a salt bridge. Further comprehension of CT448's properties could be achieved in future studies via a crystal structure and inhibitor co-crystallization. A comparative analysis of single Swedish and Polish clones of D. magna revealed that the Swedish clones exhibited a higher fitness compared to the Polish clones when exposed to the co-occurring Microcystis sp. BM25 and are capable to dominate a multiclonal experimental population in the presence of this toxic cyanobacterium. The study suggests that protease inhibitors (PI) coexisting with a tolerant Swedish Daphnia population may be involved in increased fitness. Hence, the isolation of those PIs can provide insights into the adaptive mechanisms of Daphnia. I modified the methodology of elastase activity assays in D. magna homogenates for the identification of cyanobacterial PIs and presented results on the inhibitory effect of methanol on elastase activity. Following the methodological adaptation, elastase activity assays were conducted using homogenates of D. magna clones from both populations, with fractions of Microcystis sp. BM25 cell extract. A population effect concerning elastase activity between the Swedish and Polish D. magna homogenates was not observed. This dissertation provided new characteristics and insights into a serine protease that has been subjected to positive selection driven by toxic cyanobacteria. A combination of experimental techniques, advanced biochemical methodologies and artificial intelligence technology were employed to investigate the molecular mechanisms of adaptation in Daphnia. The results demonstrate novel properties and characteristics of elastases in D. magna, offering a novel perspective on their function in tolerance to toxic cyanobacteria.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Lokale Anpassung von Daphnia magna an Proteaseinhibitoren aus Cyanobakterien - Charakterisierung der Serineprotease CT448	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Cyanobakterien sind aquatische photoautotrophe Organismen, die sich unter günstigen Bedingungen massenhaft in sogenannte „Blüten“ vermehren. Solche Cyanobakterien-Blüten haben in Süßwasserökosystemen zugenommen, was auf eine Kombination aus Eutrophierung der Gewässer, steigenden Temperaturen und hohen CO2-Konzentrationen zurückzuführen ist. Prognostiziert wird stetige Zunahme dieser Blüten, ebenso wie die Verbreitung potenziell toxinproduzierender Cyanobakterien. Viele Gattungen der Cyanobakterien produzieren toxische sekundäre Metabolite und wurden als schädlich für Menschen und Nutztiere dokumentiert, wenn diese mit stark belastetem Wasser in Kontakt kommen. Darüber hinaus ist bekannt, dass Cyanobakterien die Fitness und das somatische Wachstum des Süßwasser-Wasserflohs Daphnia sp. negativ beeinflussen und dessen Sterblichkeit erhöhen. Daphnien stellen eine wichtige Verbindung zwischen Primärproduzenten und höheren trophischen Ebenen dar. Während Blüten stellen Cyanobakterien einen großen Anteil des Phytoplanktons dar und sind damit die Hauptnahrungsquelle für die nicht selektiv filtrierenden Daphnien. Die negativen Effekte toxischer Cyanobakterien sind teilweise auf Proteaseinhibitoren (PI) zurückzuführen – sekundäre Metabolite, die Verdauungsproteasen hemmen und häufig in Blüten zu finden sind. Die Toleranz von Daphnien gegenüber toxischen Cyanobakterien kann durch zeitliche und räumliche Koexistenz hinweg zunehmen, was als lokale Anpassung bezeichnet wird. Eine aktuelle Studie zeigte, dass positive Selektion an spezifischen Genloci, die für Verdauungsproteasen kodieren, die evolutionäre Anpassung einer schwedischen Daphnia magna Population an Cyanobakterien vorangetrieben hat. Die Persistenz von Cyanobakterien-Blüten stellt eine große Herausforderung für die Bewirtschaftung von Seen dar und erfordert multifaktorielle Lösungen. Ein möglicher Ansatz könnte in der Identifikation von Daphnien mit erhöhter Toleranz gegenüber cyanobakteriellen Proteaseinhibitoren bestehen, da solche angepassten Wasserflöhe zur Kontrolle toxischer Blüten beitragen könnten. Ein tieferes Verständnis der molekularen Grundlagen dieser lokalen Anpassung könnte Einblicke in die mechanistische Hemmung von Proteasen durch sekundäre Metabolite der Cyanobakterien bieten. Ziel dieser Dissertation ist es, Veränderungen auf Proteinebene zu identifizieren, die die Toleranz einer Daphnia magna Population gegenüber Proteaseinhibitoren eines koexistierenden Cyanobakterienstamms der Gattung Microcystis erklären. Obwohl bereits Fortschritte im Verständnis dieser Anpassung gemacht wurden, sind weitere Daten notwendig, um ein umfassenderes Bild zu erhalten. Zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde eine anfällige polnische Population mit der toleranten schwedischen Population verglichen. Die Verdauungsserinprotease CT448 aus D. magna, die unter positivem Selektionsdruck stand, wurde in Sf21-Insektenzellen exprimiert. Die aufgereinigte Proteasvorstufe konnte anschließend durch tryptischen Verdauung aktiviert werden – dies stellt die erste erfolgreiche Expression einer aktiven Serinprotease aus dem Darm von Daphnia dar. Die Substratspezifität wurde durch proteomische Analysen identifiziert und zeigte, dass CT448 im Gegensatz zu bisherigen Publikationen eine chymotrypsin-ähnliche Elastase ist. Diese Studie bestätigte zudem, dass CT448 Ziel cyanobakterieller Inhibitoren ist. Die Untersuchungen dieser chymotrypsin-ähnlichen Elastase konzentrierten sich auf die Vorhersage struktureller Eigenschaften mittels der KI-basierten Software AlphaFold 3. Ziel war es, strukturelle Besonderheiten von CT448 zu erfassen, insbesondere eine auffällige Aminosäuresubstitution an Position 34 zwischen den untersuchten Populationen. Die vorhergesagte Struktur deutet darauf hin, dass das Propeptid eine funktionelle Rolle spielt und die populationsspezifische Aminosäure der schwedischen Population zur Stabilität der Protease durch eine Salzbrücke beitragen könnte. Ein tieferes Verständnis der Eigenschaften von CT448 könnte durch zukünftige Kristallstrukturanalysen und Inhibitor-Co-Kristallisationen erreicht werden. Der Vergleich einzelner Klone der schwedischen und polnischen D. magna Populationen zeigte, dass die schwedischen Klone eine höhere Fitness aufwiesen, wenn sie dem toxischen Microcystis -Stamm BM25 ausgesetzt waren, und in einem multiklonalen Versuchsaufbau die Population unter diesen Bedingungen dominieren konnten. Dies deutet darauf hin, dass Proteaseinhibitoren in Koexistenz mit der toleranten schwedischen Daphnia-Population zur erhöhten Fitness beitragen könnten. Daher könnte die Isolierung dieser PI neue Erkenntnisse über die Anpassungsmechanismen liefern. Zudem passte ich die Methodik zur Bestimmung der Elastaseaktivität in D. magna-Homogenaten an, um cyanobakterielle PI identifizieren zu können, und präsentierte Ergebnisse zur hemmenden Wirkung von Methanol auf die Elastaseaktivität. Nach methodischer Optimierung wurden Elastaseaktivitätstests mit Homogenaten beider Populationen unter Zugabe von Zellfraktionen von Microcystis sp. BM25 durchgeführt. Hierbei konnte jedoch kein populationsspezifischer Effekt auf die Elastaseaktivität festgestellt werden. Diese Dissertation liefert somit neue Erkenntnisse über eine Serinprotease, die einer positive Selektion durch toxische Cyanobakterien ausgesetzt war. Mithilfe einer Kombination aus experimentellen Techniken, modernen biochemischen Methoden und KI-Technologien wurden molekulare Anpassungsmechanismen in Daphnia untersucht. Die Ergebnisse zeigen neue Eigenschaften von Elastasen in D. magna auf und eröffnen neue Perspektiven auf deren Rolle in der Toleranz gegenüber toxischen Cyanobakterien.

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