Universität zu Köln

Johannes, Lena (2023). Isolated sulfite oxidase deficiency: potential treatment strategies and discovery of a novel dermal phenotype. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Isolated sulfite oxidase deficiency (SOXD) is a rare autosomal recessively inherited disease presenting with severe seizures, neurological damage and altered facial and head morphology, which collectively lead to infant death if left untreated. It can be caused by a loss of function of the mitochondrial molybdoenzyme sulfite oxidase (SOX) due to mutation in the SUOX gene (named SOXD) or by defects in the biogenesis of its molybdenum cofactor (named MoCD), forming the active site of the enzyme. The disease is characterized by a vast increase of sulfite and related sulfur-containing metabolites, including S-sulfocysteine, in urine accompanied by a decrease of plasma cystine and homocysteine levels. Sulfite is a molecule with strong nucleophilic properties that has the ability to cleave disulfide bonds and thus globally affect protein stability and function. In contrast to the versatile mechanism of sulfite-mediated toxicity, SSC functions as a structural analogue of glutamate triggering N-methyl D-aspartate receptor (NMDAR)-mediated excitotoxicity resulting in elevated neurodegeneration. Up to date, effective long-term treatment strategies are still lacking for SOXD. So far, therapy is restricted to symptomatic treatment including anti-epileptic medication aiming for a reduction in seizures and spasticity. Deceleration of the disease progression was attempted via dietary restriction of sulfur-containing amino acids to reduce cysteine catabolism and thus sulfite formation, but has only proven successful in mild, late onset cases of SOXD. The generation of a Suox-/- mouse line provided a new model system to investigate the effects of non-functional SOX on the symptom progression of SOXD and thus new possibilities in the search for an effective long-term treatment. Hence, the current study investigated several therapeutic approaches aiming to treat SOXD in mice by (i) blockage of NMDAR-mediated excitotoxicity, (ii) dietary restriction of proteins and sulfur-containing amino acids, (iii) chemical sulfite scavenging, (iv) inhibition of ferroptosis and (v) an enzyme replacement therapy using a modified SOX variant. The results indicate an absence of beneficial effects of NMDAR blockage on the survival time of Suox-/- mice, which is in line with their cerebral phenotype being significantly milder than reported in patients, thus suggesting a different underlying cause of death, which is in strong contrast to the disease progression in human patients. Therapeutic prevention of major sulfite accumulation was attempted by dietary restriction of sulfur-containing amino acids to reduce cysteine catabolism. However, dietary restriction proved difficult in mice, as manipulation of the mother’s chow to alter the diet of pups complicated the right dosage finding, thus resulting in no improvement of the phenotype. An attempt to reduce sulfite accumulation via usage of different thiol-reactive compounds (D-cysteine/cystine, cystamine) did also not improve the symptomatology or life span of Suox-/- mice. As it nevertheless presents an easy, straightforward treatment approach, chemical sulfite scavenging still holds great potential for future studies on the treatment of SOXD. Based on the fact that SOXD causes cystine depletion, we hypothesized a pathomechanism that involves the regulated cell death pathway ferroptosis, which is characterized by increased levels of intracellular lipid peroxidation caused by a depletion of cysteine and glutathione. However, the current study excluded the contribution of ferroptosis to the phenotype of Suox-/- mice. In contrast, absence of SOX activity resulted in an inhibition of ferroptosis, which is hypothesized to be caused by a faster recovery of reduced glutathione due to sulfite-mediated cleavage of disulfide bonds in intracellular glutathione disulfide and was also confirmed by reduced lipid peroxidation in kidneys of Suox-/- mice. Enzyme replacement therapy presented an alternative treatment approach aiming for the reconstitution of SOX activity. Murine SOX lacking the heme domain was utilized to allow usage of blood-dissolved oxygen as a final electron acceptor for sulfite oxidation in vivo. The treatment resulted in a small, but significant increase in the average survival time of Suox-/- mice and upon further advancement presents a promising treatment strategy for SOXD in mice, which in the long term might lead to the discovery of a potent therapy usable for SOXD in humans as well. In the course of the current study, a difference in the cause of death between human SOXD patients and Suox-/- mice became apparent. In line with this, a dermal phenotype was discovered and investigated in Suox-/- mice, which is characterized by epidermal hyperproliferation and defective terminal differentiation presumably caused by the sulfite-mediated cleavage of disulfide bonds in keratins and other structural proteins, which are crucial for structural integrity of the epidermis. The data strongly suggest the development of an epidermal barrier defect in the progression of the disease, but future studies will be required to unravel the contribution of the observed phenotype to the overall lethality in those mice.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Isolierte Sulfitoxidasedefizienz (SOXD) ist eine seltene, autosomal-rezessive Erbkrankheit, die mit schweren Krämpfen, neurologischen Schäden und Veränderungen der Gesichts- und Schädelmorphologie, einhergeht und unbehandelt zu einem frühen Tod führt. Sie wird durch einen Funktionsverlust des mitochondrialen Molybdoenzyms Sulfitoxidase (SOX) entweder aufgrund von Mutationen des SUOX-Gens (SOXD) oder durch Defekte in der Biogenese des Molybdäncofaktors (MoCD), der das aktive Zentrum des Enzyms bildet, verursacht. Die Krankheit ist durch einen starken Anstieg der Konzentrationen von Sulfit und schwefelhaltigen Metaboliten wie beispielsweise S-sulfocystein im Urin gekennzeichnet, der mit einem Rückgang der Cystin- und Homocysteinwerte im Plasma einhergeht. Sulfit ist ein Molekül mit stark nukleophilen Eigenschaften, das Disulfidbrücken spalten und so die Stabilität und Funktion von Proteinen global beeinflussen kann. Im Gegensatz zu dem vielseitigen Mechanismus der Sulfit-vermittelten Toxizität löst SSC als strukturelles Analogon von Glutamat hauptsächlich N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) Rezeptor-vermittelte Exzitotoxizität aus, die zu Neurodegeneration führt. Bis heute gibt es keine wirksamen langfristigen Behandlungsstrategien für SOXD. Bisher beschränkt sich die Therapie hauptsächlich auf die symptomatische Behandlung mit Antiepileptika, die auf eine Verringerung der Anfälle und Spastik abzielen. Eine Verlangsamung des Krankheitsverlaufs wird durch eine verringerte Aufnahme von schwefelhaltigen Aminosäuren über die Nahrung angestrebt, um den Cysteinkatabolismus und somit die Bildung von Sulfit zu reduzieren, hat sich jedoch nur bei milden, spät auftretenden Fällen von SOXD als erfolgreich erwiesen. Die Generierung einer Suox-/- Mauslinie lieferte ein neues Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen von nicht-funktioneller SOX auf den Krankheitsverlauf von SOXD und bot damit neue Möglichkeiten für die Suche nach einer wirksamen Langzeitbehandlung. Daher untersuchte die vorliegende Studie mehrere Therapieansätze zur Behandlung von SOXD in Mäusen durch (i) Blockierung NMDA-Rezeptor-vermittelter Exzitotoxizität, (ii) Einschränkung der Aufnahme von Proteinen und schwefelhaltigen Aminosäuren über die Nahrung, (iii) chemisches Abfangen von Sulfit, (iv) Inhibition von Ferroptose und (v) eine Enzymersatztherapie unter Verwendung einer modifizierten SOX-Variante. Die Ergebnisse zeigen keine positiven Auswirkungen der Blockierung von NMDA-Rezeptoren auf die Überlebenszeit von Suox-/- Mäusen. Dies stimmt überein mit der Tatsache, dass der zerebrale Phänotyp deutlich milder ausgeprägt ist als bei humanen Patienten, was auf eine andere zugrunde liegende Todesursache schließen lässt, und in starkem Kontrast zum Krankheitsverlauf bei menschlichen Patienten steht. Eine therapeutische Verhinderung übermäßiger Sulfitakkumulation wurde durch eine Einschränkung der Aufnahme schwefelhaltiger Aminosäuren in der Nahrung zur Reduzierung des Cysteinkatabolismus angestrebt. Die Einschränkung der Ernährung bei Mäusen erwies sich jedoch als schwierig, da eine Manipulation des Futters der Mutter zur Veränderung der Ernährung der neugeborenen Mäuse die richtige Dosierung erschwerte, sodass keine Verbesserung des Phänotyps erzielt werden konnte. Ein direkter Versuch, die Sulfitakkumulation durch die Verwendung verschiedener Thiol-reaktiver Verbindungen (D-Cystein/Cystin, Cystamin) zu reduzieren, führte ebenfalls nicht zu einer Verbesserung der Symptomatik oder Lebensdauer von Suox-/- Mäusen. Da es sich dennoch um einen einfachen und unkomplizierten Behandlungsansatz handelt, birgt chemisches Abfangen von Sulfit großes Potenzial für zukünftige Studien zur Behandlung von SOXD. Da SOXD eine Depletion von Cystin verursacht, stellten wir die Hypothese auf, dass der regulierte Zelltodweg Ferroptose für einen Pathomechanismus der SOXD verantwortlich ist. Ferroptose ist durch eine erhöhte intrazelluläre Lipidperoxidation gekennzeichnet, die durch einen Cystein- und Glutathionmangel verursacht wird. Die aktuelle Studie schloss jedoch einen Beitrag der Ferroptose zum Phänotyp von Suox-/- Mäusen aus. Im Gegenteil führte der Funktionsverlust der SOX zu einer Inhibition der Ferroptose, was vermutlich auf eine schnellere Wiederherstellung von reduziertem Glutathion aufgrund der Sulfit-vermittelten Spaltung von Disulfidbindungen im intrazellulären Glutathiondisulfid zurückzuführen ist und durch eine verringerte Lipidperoxidation in den Nieren von Suox-/- Mäusen bestätigt wurde. Die Enzymersatztherapie stellt einen alternativen Behandlungsansatz dar, der eine Wiederherstellung der SOX-Aktivität anstrebt. Durch die Verwendung von muriner SOX ohne Häm-Domäne ist es möglich, den im Blut gelösten Sauerstoff als finalen Elektronenakzeptor für die Sulfitoxidation in vivo zu nutzen. Die Behandlung führte zu einer begrenzten, aber signifikanten Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit von Suox-/- Mäusen und stellt in weiterentwickelter Form eine vielversprechende Behandlungsstrategie für SOXD in Mäusen dar, die langfristig auch zur Entdeckung einer wirksamen Therapie für SOXD im Menschen führen könnte. Im Verlauf der aktuellen Studie zeigten sich Unterschiede in den Todesursachen von menschlichen SOXD-Patienten und Suox-/- Mäusen. Damit übereinstimmend wurde bei Suox-/- Mäusen ein dermaler Phänotyp entdeckt und untersucht. Dieser zeichnet sich aus durch epidermale Hyperproliferation und fehlerhafte terminale Differenzierung, die vermutlich durch die Sulfit-vermittelte Spaltung von Disulfidbindungen in Keratinen und anderen Strukturproteinen verursacht werden, die für die strukturelle Integrität der Epidermis essentiell sind. Die Daten deuten stark auf die Ausbildung eines epidermalen Barrieredefekts im weiteren Krankheitsverlauf hin, aber weitere Studien sind erforderlich, um den Beitrag des beobachteten Phänotyps zur Letalität der Mäuse aufzuklären. UNSPECIFIED
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Johannes, Lena lenaa.johannes2510@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-787448
Date:	2023
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Isolated sulfite oxidase deficiency UNSPECIFIED sulfite oxidase UNSPECIFIED dermal phenotype UNSPECIFIED treatment strategies UNSPECIFIED
Date of oral exam:	27 September 2023
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Günter Prof. Dr. Rugarli, Elena Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/78744