Universität zu Köln

Gehling, Maria-Theresa ORCID: 0009-0008-6962-6147 (2025). Synaptic targeting and (re-)localization of gephyrin by thiol-modifications. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

As a bifunctional protein, gephyrin is involved in molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis as well as the clustering of receptors at the inhibitory synapse. Dysfunctions of gephyrin are linked to neurodegenerative diseases, such as encephalopathy, autism, epilepsy and Alzheimer’s disease. Dynamic regulation of gephyrin is further important for the modulation of neurotransmission, known as synaptic plasticity. Thus, understanding of gephyrin function and its regulation is crucial. Gephyrin is highly regulated by post-translational modifications (PTMs) targeting primarily its central C-domain that connects the N-terminal G- and the C-terminal E domain. PTMs of gephyrin have been shown to regulate synaptic clustering, localization, stability and receptor interaction. However, the interplay of these PTMs and the underlying molecular mechanisms are not fully understood. Moreover, most PTMs were studied in vitro and in cellulo, leaving their biological relevance in vivo unclear. This work aimed to understand the interplay of several PTMs regulating gephyrin by S-nitrosylation, S-palmitoylation as well as the interaction with dynein light chain (DLC) and to generate a mouse model for the investigation of these PTMs in vivo. In addition, this work aimed to identify the unknown roles of surface-exposed cysteines of gephyrin in a redox-dependent context. Using several biochemical, cellular and animal experiments, this work revealed new insight into gephyrin regulation through PTMs and the role of the C-domain. A novel dynein-independent role of DLC was identified that regulates S-nitrosylation and S palmityoaltion, competing for the same Cys212 and Cys284, in a reciprocal way. The underlying mechanism involves the formation of a ternary complex with gephyrin, neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and DLC. DLC inhibits nNOS-mediated NO production and thus allows for S-palmitoylation. Gephyrin phosphorylation at Thr205 inhibits DLC binding permitting nNOS-mediated S-nitrosylation. Furthermore, it was found that surface-exposed cysteines of gephyrin are redox sensitive and important for redox-dependent synaptic clustering of gephyrin. The mechanism driving oxidation-mediated synaptic clustering involves oligomerization of gephyrin through disulfide bridges, which strengthens receptors clustering and increases resistance to proteolytic cleavage. A physiological source for gephyrin oxidation was identified as mitochondria-derived reactive oxygen species (mROS) linking neuronal and mitochondrial activities, important for aging and disease mechanisms. Finally, a novel mouse model carrying a microdeletion of residue 199-233 (∆199 233) was generated, allowing for the investigation of the contribution of this C-domain area for gephyrin function in vivo. The phenotype of homozygous mice (∆/∆) was severe, causing high-mortality, epileptic-like seizures and weight loss before weaning age. The pathogenicity mechanism was narrowed down to disturbed synaptic targeting of gephyrin through loss of S-palmitoylation and PTM-independent structural modulation of the gephyrin-receptor interaction. These combined alterations caused a reduction in inhibitory transmission and adaptation at excitatory synapses, resulting in a disturbed excitation and inhibition interplay thus manifesting the hyperexcitation and epileptogenic phenotype in ∆/∆ mice. In summary, this work sheds light on the importance and interplay of three thiol based PTMs of gephyrin: S-nitrosylation, S-palmitoylation and Cys-reduction/oxidation. Furthermore, it extends the understanding of the C-domain beyond its role as a regulatory hub for the function of gephyrin through structural flexibility and PTMs, as a PTM-independent modulator of gephyrin-receptor interactions. The findings within this work extend our knowledge about gephyrin-dependent synaptic plasticity and offer potential for developing therapies for gephyrin-dependent neurodegenerative diseases and may be representative of other post-synaptic proteins.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Gephyrin ist an der Biosynthese des Molybdän-Cofaktors (Moco) und der Clusterbildung von Rezeptoren an der inhibitorischen Synapse beteiligt. Funktionsstörungen von Gephyrin stehen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Enzephalopathie, Autismus, Epilepsie und Alzheimer. Die dynamische Regulation von Gephyrin ist wichtig für die Modulation der Neurotransmission, bekannt als synaptische Plastizität. Daher ist das Verständnis der Funktion von Gephyrin und seiner Regulation von großer Bedeutung. Gephyrin wird durch verschiedene post-translationale Modifikationen (PTMs) innerhalb seiner zentralen C-Domäne reguliert, welche die N-terminale G-Domäne und die C-terminale E-Domäne verbindet. Diese PTMs kontrollieren die synaptische Clusterbildung, Lokalisation, Stabilität und Rezeptorinteraktion von Gephyrin. Allerdings sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch nicht vollständig verstanden, und die biologische Relevanz der meisten PTMs in vivo bleibt unklar. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Zusammenspiel mehrerer PTMs, die Gephyrin regulieren, zu verstehen, einschließlich S-Nitrosylierung, S-Palmitoylierung sowie die Interaktion mit Dynein light chain (DLC). Darüber hinaus sollte ein Mausmodell erstellt werden, um diese PTMs in vivo zu untersuchen. Daneben sollte die unbekannte Rolle der oberflächenexponierten Cysteine von Gephyrin, die nicht mit S-Palmitoylierung und S-Nitrosylierung in Verbindung stehen, identifiziert werden. Verschiedene biochemische, zelluläre und tierexperimentelle Methoden führten zu neuen Erkenntnissen über die Regulation von Gephyrin durch PTMs und die Rolle der C-Domäne. Eine neuartige Dynein-unabhängige Rolle von DLC wurde identifiziert, die S Nitrosylierung und S-Palmitoylierung von Gephyrin, welche um die gleichen Cysteine 212 und 284 konkurrieren, reguliert. Der Mechanismus umfasst die Bildung eines ternären Komplexes aus Gephyrin, neuronaler Stickstoffmonoxidsynthase (nNOS) und DLC. DLC hemmt die nNOS-abhängige NO-Produktion und ermöglicht so Gephyrin-S-Palmitoylierung. Phosphorylierung von Gephyrin an Thr205 inhibiert die Bindung zu DLC und ermöglicht nNOS-abhängige S-Nitrosylierung von Gephyrin. Es wurde festgestellt, dass die oberflächenexponierten Cysteine von Gephyrin redox sensitiv sind und für die redox-abhängige synaptische Clusterbildung wichtig sind. Der Mechanismus umfasst die Verbindung von Gephyrin-Molekülen durch Disulfidbrücken, die die Rezeptorclusterung verstärken. Eine physiologische Quelle für die Oxidation von Gephyrin wurde als mitochondrial erzeugte reaktive Sauerstoffspezies (mROS) identifiziert, was neuronale und mitochondriale Aktivität verbindet und für alterungsbedingte sowie neurodegenerative Krankheitsmechanismen wichtig ist. Schließlich wurde ein Mausmodell mit einer Mikrodeletion der Reste 199-233 (∆199 233) erzeugt, das die Untersuchung des Beitrags dieses C-Domänenbereichs zur Funktion von Gephyrin in vivo ermöglicht. Der Phänotyp der homozygoten Mäuse (∆/∆) war schwerwiegend und verursachte hohe Sterblichkeit, epilepsieartige Anfälle und Gewichtsverlust vor dem Absetzalter. Der Pathomechanismus wurde auf eine gestörte, synaptische Rekrutierung von Gephyrin durch Verlust der S-Palmitoylierung und PTM unabhängige strukturelle Modulation der Gephyrin-Rezeptor-Interaktion eingegrenzt. Diese Veränderungen führten zu einer Reduktion der inhibitorischen Transmission und Anpassungen an exzitatorische Synapsen, was zu einem gestörten Verhältnis zwischen Erregung und Hemmung führte und zum hyperexzitatorischen und epileptogenen Phänotyp in ∆/∆-Mäusen beitrug. Zusammenfassend beleuchtet diese Arbeit die Bedeutung und das Zusammenspiel dreier thiolbasierter PTMs von Gephyrin: S-Nitrosylierung, S-Palmitoylierung und Cystein Reduktion/Oxidation. Des Weiteren erweitert sie das Verständnis der C-Domäne als PTM unabhängigen Modulator der Gephyrin-Rezeptor-Interaktionen. Die gewonnenen Erkenntnisse erweitern unser Wissen über die Gephyrin-abhängige synaptische Plastizität und bieten Potenzial für die Entwicklung von Therapien für Gephyrin-abhängige neurodegenerative Erkrankungen und könnten repräsentativ für andere synaptische Proteine sein. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Gehling, Maria-Theresa tgehling192@gmail.com orcid.org/0009-0008-6962-6147 UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-789474
Date:	2025
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Inhibitory Synapse English Thiol Chemistry English Neurobiochemistry English
Date of oral exam:	17 September 2024
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Günter Prof. Dr. Ulrich, Kathrin Prof.in Dr. Multhaup, Gerhard Prof. Dr.
Funders:	Reloc 2550 (DFG funding)
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/78947