Universität zu Köln

Abdelwahab, Yasmin (2025). Development of a New Class of Necroptosis Inhibitors That Bind Allosterically to Human and Mouse MLKL. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Nekroptose ist eine Form des regulierten Zelltods, die zum Platzen der Plasmamembran, und somit zur Freisetzung von Zellbestandteilen und zur Immunantwort führt. Mixed Lineage Kinase domain-like pseudokinase (MLKL) ist das Effektorprotein, das für die Permeabilisierung der Plasmamembran bei der Nekroptose verantwortlich ist. Nekroptose ist mit einer Vielzahl entzündlicher Erkrankungen assoziiert. Aus diesem Grund ist die Inhibierung von MLKL eine attraktive Therapiemöglichkeit, da es das einzige Protein in der Signalkette ist, das ausschließlich mit Nekroptose assoziiert wird. Die Entwicklung neuer MLKL-Inhibitoren steckt jedoch noch in den Anfangsstadien und die existierenden Inhibitoren weisen viele Einschränkungen auf. Im Labor von Prof. Dr. Ana Garcia-Saez wurde eine hydrophobe Tasche in MLKL identifiziert, die als Angriffspunkt für Inhibitoren dienen könnte. Auf dieser Grundlage wurde eine neue Strategie entwickelt, um die Nekroptose gezielt zu regulieren, indem MLKL durch kleine Moleküle, die mit dieser Stelle interagieren, allosterisch gehemmt wird. Zwei Proof-of-Principle Verbindungen (MBA-h1 und MBA-m1) wurden durch in silico Analysen identifiziert. In dieser Arbeit wurden diese beiden Verbindungen in zellbasierten Assays charakterisiert: ihre inhibitorische Wirkung auf die Nekroptose, der Mechanismus, mit dem sie die Aktivierung von MLKL modulieren, und ihre Bindung an MLKL wurden bestimmt. Zusätzlich wurde ihre Wechselwirkung mit rekombinantem MLKL untersucht. Beide MBAs waren in der Lage, MLKL zu binden und die Zelltodkinetik dosisabhängig zu hemmen. Die aus den MBAs gewonnenen Erkenntnisse ermöglichten die Suche nach neuen Verbindungen mit ähnlichem Wirkmechanismus. Darauf aufbauend wurde ein erweitertes In-silico-Screening durchgeführt, bei dem potenzielle Treffer identifiziert und in vitro hinsichtlich ihrer Bindung an MLKL und Inhibierung charakterisiert wurden. Diesem Screening folgten zwei weitere Runden zur Charakterisierung von Analoga der identifizierten Treffer .Die besten Verbindungen übertrafen die bereits existierenden MLKL-Inhibitoren, da sie in der Lage waren, die Nekroptose sowohl in menschlichen als auch in Mauszellen zu hemmen. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit ein neuer Ansatz zur Hemmung der Nekroptose vorgeschlagen. Die Hemmung basiert auf einer neu identifizierten intramolekularen Interaktion in MLKL, die für seine Aktivierung essentiell ist.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Necroptosis is a form of regulated cell death that results in the release of inflammatory cellular contents after plasma membrane permeabilization, thus triggering the immune response. Mixed Lineage Kinase domain-like pseudokinase (MLKL) is the protein that mediates plasma membrane disruption in necroptosis. This type of cell death has been linked to a broad range of inflammatory diseases. Therefore, targeting MLKL to inhibit necroptosis represents an attractive strategy, as this protein is the only one solely associated with this pathway. However, the development of MLKL inhibitors is still in its infancy, and the existing ones are limited to lab research. In Prof. Dr. Ana Garcia Saez's lab, a new druggable hydrophobic pocket in MLKL was discovered. Based on this knowledge, a new strategy was developed to specifically regulate necroptosis by allosterically targeting MLKL with small molecules that interact with this site. Two proof of principle compounds (MBA-h1 and MBA-m1) were identified by in-silico analysis. In this thesis, we characterized these two compounds using cell-based assays aimed to determine their inhibitory effect in necroptosis, the mechanism of how they modulate MLKL activation, and their binding to MLKL. We also assessed their capability to interact with recombinant MLKL. Both MBAs were able to bind to MLKL and inhibit the kinetics of cell death in a dose-dependent manner. The MBAs paved the way for the investigation of new compounds that have the same mechanism of action. Based on this, an extended in-silico screening was performed, and potential hits were identified and characterized in terms of their inhibition and binding to MLKL in-vitro. This screening was followed by two further rounds of characterization of analogs of initially identified hits. The top compounds outperform already existing MLKL inhibitors as they block necroptosis in mouse and human cells. Therefore, in this work, we offer a new concept for inhibiting necroptosis that is based on targeting a newly identified intramolecular interaction in MLKL, that is essential for its activation. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Abdelwahab, Yasmin UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-790007
Date:	2025
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CECAD - Cluster of Excellence Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
Subjects:	Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language necroptosis UNSPECIFIED MLKL UNSPECIFIED MLKL inhibitors UNSPECIFIED
Date of oral exam:	26 February 2024
Referee:	Name Academic Title J. García-Saéz, Ana Prof. Dr
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/79000