The changing roles of Hox3 genes in insect evolution: characterizing the zen paralogues in the beetle Tribolium castaneum

Gurska, Daniela (2017). The changing roles of Hox3 genes in insect evolution: characterizing the zen paralogues in the beetle Tribolium castaneum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Daniela_Gurska_PhD_Thesis.pdf
Download (11MB)

Abstract

Hox genes encode transcription factors responsible for the determination of axial patterning of all bilaterian embryos. However, insect Hox3 orthologues, named zerknüllt (zen), have changed their function multiple times, which led to the abandonment of the canonical Hox function, and subsequent switch of their functional domain from embryonic to extraembryonic tissue. To date, in fact, all described zen genes play role in extraembryonic membranes (EEMs). The EEMs protect the embryos from the insults of the outer environment and their formation allowed insects to oviposit in various niches, ultimately allowing them to colonize land. The evolution of the EEMs is tightly linked to the evolution of Hox3/zen. Concurrently with the origin of EEMs, Hox3 has gradually switched from embryonic role to zen´s function in the EEMs. However, it is only within winged insect that the complete transition from Hox3 to zen and complete EEMs are observed. Further, besides switching to extraembryonic tissue, in this new domain, zen genes have also acquired two different functions: one in early tissue specification and the other in late morphogenesis. However, little is known about the causes triggering the switch from Hox3 to zen, and the subsequent functional divergence of zen. Here, in order to get insight into what has triggered the functional divergence of zen, I focused on the holometabolous beetle Tribolium castaneum, as two functionally diverged paralogues were described: one with the function during early embryogenesis (Tc-zen1) and the second one with the function during late embryogenesis (Tc-zen2). In order to decipher how the two diverged functions of Tc-zen1 and Tc-zen2 were acquired, I investigated transcriptional and translation regulation of both Tc-zen genes during early and late embryogenesis. I showed that, although the early function was described only for Tc-zen1, both paralogues reach their expression peak during early embryogenesis. To reveal the degree of divergence in transcriptional targets between the paralogues during early development, I knocked down (via parental RNA interference, pRNAi) the Tc-zen genes and performed RNA-sequencing (RNA-seq). Differential expression (DE) analysis and the subsequent comparative analysis of the identified targets of Tc-zen1 and Tc-zen2 suggest that the paralogues do not share substantial number of transcriptional targets during early embryogenesis. Additionally, principal component analysis revealed that despite the early expression of both paralogues, the impact of Tc-zen2 knockdown on early transcriptional control was significantly lower than for Tc-zen1, which is consistent with Tc-zen2 having a late function. Nonetheless, the analysis of expression levels of each zen gene in knockdown samples of its paralogue revealed a subtle regulatory function of Tc-zen2 during early embryogenesis, particularly in repression of Tc-zen1. To further investigate transcriptional regulation by Tc-zen2 during late embryogenesis, I have first showed that after the Tc-zen2 expression peak is reached during early embryogenesis, the low transcript expression persists until the late development. Consistent with the timing of the transcript expression, I showed that Tc-Zen2 protein is present until the late developmental stage, where its function takes place. To identify transcriptional targets of Tc-zen2 during late embryogenesis, I performed the second RNA-seq after pRNAi experiment. DE analysis revealed much higher impact of Tc-zen2 on transcriptional control during late embryogenesis than during early embryogenesis. The functional profile of candidate target genes of Tc-zen2 during late embryogenesis was obtained by thorough gene ontology (GO) term analysis. Consistent with the phenotypic manifestation of the morphogenesis function of Tc-zen2 during late embryogenesis, many of the identified candidate targets were assigned to GO terms with function in epithelial morphogenesis. In conclusion, the results obtained within the presented project suggest that acquirement of the two distinct functions of Tc-zen paralogues might be partially explained by two different transcriptional signatures they attained. While the function of Tc-zen1 temporally correlates with its expression peak and transcriptional regulation of its downstream targets, Tc-zen2, although expressed early, has very low impact on the downstream transcriptional regulation during early embryogenesis. Moreover, the fact that Tc-zen paralogues share very few targets during early embryogenesis suggests only subtle early regulatory roles of Tc-zen2 and separation of its morphogenesis function to late embryogenesis. This result was further endorsed by observation of Tc-zen2 transcript and protein expression throughout embryogenesis until the Tc-zen2 late function takes place. In addition, I identified a much higher number of Tc-zen2 candidate transcriptional targets during late embryogenesis, of which many likely play roles in epithelial morphogenesis. These diverse lines of evidence suggests that the diverged functions of Tc-zen1 and Tc-zen2 might have been acquired by regulation of different downstream transcriptional targets, which could have ultimately allow for separation of Tc-zen paralogues functions to early and late development.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Hox-Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren, die für die Determination der axialen Muster der Embryonen von bilaterialen Lebewesen verantwortlich sind. Die Insekten-Orthologe des Hox3-Gens, genannt zerknüllt (zen), haben jedoch ihre Funktion mehrmals gewandelt. Das hat zum Verlust der kanonischen Hox-Funktion geführt und zu einer Verschiebung ihrer funktionalen Domäne von embryonalem Gewebe zu extraembryonalem Gewebe. Alle bis heute beschrieben zen-Gene haben eine Rolle in extraembryonalen Membranen (EEM). Diese Membranen schützen den Embryo vor äußeren Einflüssen und erlauben Insekten, in verschiedenen Nischen Eier abzulegen. Das hat ihnen letztendlich erlaubt auch das Land zu kolonisieren. Die Evolution von der EEMs ist mit der Evolution von Hox3/zen eng verknüpft. Gleichzeitig mit der Entstehung der EEMs hat sich die Rolle von Hox3 in der Entwicklung des Embryos allmählich zu der Funktion von zen in extraembryonalen Membranen gewandelt. Nur in geflügelten Insekten ist diese Transition vollständig und vollständige EEMs können beobachtet werden. Neben der Verlagerung der Funktion von zen haben diese Gene in ihrer neuen Expressionsdomäne zwei neue Rollen übernommen: eine in der frühen Gewebespezifiaktion sowie eine in der späten Morphogenese. Bisher ist jedoch wenig über die Gründe für die Wandlung von Hox3 zu zen bekannt, genauso wenig wie über die funktionelle Divergenz von zen. Um die Auslöser für die funktionelle Wandlung des Hox3-Gens zu untersuchen, habe ich mich bei meinen Untersuchungen auf den holometabolen Käfer Tribolium castaneum konzentriert, in dem zwei funktionell divergente Paraloge von zen beschrieben sind: eines mit einer Funktion in der frühen Embryogenese (Tc-zen1) und das zweite mit einer Funktion in der späten Embryogenese (Tc-zen2). Um zu erforschen, wie die zwei divergenten Funktionen von Tc-zen1 und Tc-zen2 erworben wurden, habe ich die Expressions- und Translationsregulation durch beide Gene während der frühen und späten Embryogenese untersucht. Ich konnte zeigen, dass beide Paraloge höchste Expression in der frühen Embryogenese zeigen, obwohl bisher nur für Tc-zen1 eine frühe Funktion beschrieben ist. Um den Grad der Divergenz von Zielgenen zwischen beiden Paralogen in der frühen Embryonalentwicklung zu zeigen, habe ich die Translation der Tc-zen-Gene mittels parentaler RNAi unterdrückt und RNA-Expressionsanalyse in den Nachkommen durchgeführt. Die Analyse der differentiellen Expression und nachfolgende vergleichende Analysen der identifizierten, potentiellen Zielgene von Tc-zen1 und Tc-zen2 deuten darauf hin, dass beide Paraloge keine wesentliche Menge von Zielgenen in der frühen Embryonalentwicklung teilen. Außerdem deckte eine Hauptkomponentenanalyse auf, dass trotz der frühen Expression beider Gene, der Knockdown von Tc-zen2 wesentlich weniger Auswirkungen auf die frühe Transkriptionskotrolle hat, als der Knockdown von Tc-zen1. Dieses Ergebnis stimmt mit der beschriebenen, späten Funktion von Tc-zen2 überein. Die Untersuchung der Expressionsniveaus beider Tc-zen-Gene in RNAi-Embryonen des jeweiligen Paralogs zeigte jedoch eine subtile regulatorische Funktion von Tc-zen2, vor allem in der Repression von Tc-zen1. Weitere Analysen der Expressionsregulation von Tc-zen2 zeigten, dass eine niedrige Expression des Transkripts bis in die späte Embryonalentwicklung bestehen bleibt, obwohl die höchste Expression von Tc-zen2 bereits in der frühen Entwicklung vorherrscht. Passend zu der Expression von Tc-zen2-mRNA ist auch das Tc-zen2-Protein bis in die späte Embryonalentwicklung präsent, wo dessen bisher einzige Fiktion beschrieben war. Um Zielgene von Tc-zen2 zu identifizieren habe ich eine weitere RNA-Expressionsanalyse durchgeführt. Ein Ergebnis dieser Analyse war, dass Tc-zen2 eine viele höhere Wichtigkeit bei der Transkriptionskontrolle in der späten als in der frühen Embryonalentwicklung hat. Durch gründliche Gen-Ontologie-Analysen wurde ein Funktionsprofil potentieller Zielgene von Tc-zen2 in der späten Embryonalentwicklung angefertigt. Passend zu der bereits beschriebenen Funktion von Tc-zen2 in der späten Embryogenese, konnten vielen der identifizierten Kandidaten Gen-Ontologien zugewiesen werden, die eine Funktion in epithelialer Morphogenese aufweisen. Zusammenfassend für Ergebnisse dieses Projekts kann also gesagt werden, dass die unterschiedlichen Funktionen der Tc-zen-Paraloge durch die unterschiedlichen transkritionalen Signaturen begründet werden können. Während die Funktion von Tc-zen1 mit dessen höchster Expression und dessen transkriptioneller Regulation seiner Zielgene korreliert, hat Tc-zen2 nur eine vergleichsweise geringeren Einfluss auf die transkritionale Regulation in der frühen Embryogenese. Da außerdem beide Tc-zen-Paraloge wenige Zielgene teilen und die regulatorische Funktion von Tc-zen2 in der Frühentwicklung gering ist, kann eine Unterscheidung der Rollen von Tc-zen1 und Tc-zen2 in die frühe und späte Embryonalentwicklung angenommen werden. Diese Annahme wird durch den Nachweis von Tc-Zen2 während der gesamten Embryonalentwicklung bis zu dessen beschriebener Funktion unterstützt. Außerdem konnte ich eine viel größere Anzahl an potentiellen Zielgenen für Tc-zen2 während der späten Embryogenese identifizieren wovon viele eine mögliche Rolle in der Morphogenese von Epithelien haben könnten. Diese unterschiedlichen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die divergenten Funktionen der Tc-zen-Paraloge zunächst durch die Regulation unterschiedlicher Zielgene entstanden sein könnten und dann dadurch in unterschiedliche Funktionen in der frühen und späten Embryonalentwicklung unterschieden wurden.

German

Creators: