Universität zu Köln

Vogt, Theresa (2017). Analyse des Succinat-Dehydrogenase-Inhibitors Fluopyram im Nematoden Caenorhabditis elegans. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der Wirkungen von subletalen und letalen Dosen des gegen Pilze und pflanzenparasitische Nematoden eingesetzten Succinat-Dehydrogenase (SDH) Inhibitors Fluopyram (FP) in Bezug auf den Lebenszyklus des freilebenden Nematoden C. elegans. Weiterhin sollte der Wirkungsmechanismus von FP auf zellbiologischer und molekularer Ebene charakterisiert werden. Nach Etablierung entsprechender Assays für die FP-Behandlung (1-50 ppm) konnte gezeigt werden, dass FP die Entwicklung von C. elegans und die anderer freilebender Nematoden konzentrationsabhängig inhibiert. In C. elegans ist die kritische Konzentration bei permanenter FP-Inkubation ≥5 ppm für die Embryogenese (geringe Kutikuladefekte) und ≥2 ppm für die Entwicklung der Larve (verlangsamt) zum fertilen adulten Tier (reduzierte Nachkommenschaft). Bei höheren FP-Konzentrationen kommt es zu einer Inhibition der Embryonalentwicklung, die konzentrationsabhängig früh (vor der Gastrulation) oder später (während der Morphogenese) auftritt. Hohe FP-Konzentrationen führen außerdem zu einem Arrest der Larvalentwicklung oder dem Auftreten von sterilen, adulten Tieren mit einer veränderten Morphologie der Kutikula. In Pulsexperimenten tolerieren der C. elegans Embryo und die L1-Larve FP-Konzentrationen von jeweils 10 ppm für 8 min bzw. 4 Tage. FP, das den Würmern mit den Fütterbakterien verabreicht wird, entfaltet seine Wirkung nicht ausschließlich durch die Nahrungsaufnahme. Da FP die Eihülle des C. elegans Embryos überwindet, penetriert es wahrscheinlich auch direkt die Kutikula von Larven und adulten Tieren. Sowohl die C. elegans mev-1 Mutante, die eine Punktmutation in der Ubichinon-Bindungstasche der SDH trägt (G71E in der SDHC-Untereinheit) als auch die in einem Mutagenese Screen neu isolierten Mutanten (z. B. Mutation des Komplex I der Elektronentransportkette) sind resistent gegenüber einer FP-Konzentration von 10 ppm. Die mev-1 Mutante kann den durch die FP-Behandlung induzierten Effekt wahrscheinlich zum Teil durch eine Hyperfusion der Mitochondrien kompensieren, wohingegen der FP-behandelte Wildtyp eine Fragmentierung der Mitochondrien aufweist. Ein phylogenetischer Vergleich der Aminosäuresequenzen der SDHC-Untereinheit, die Teil der Ubichinon-Bindungsstelle sind, zeigte ein konserviertes Glycin (Position 71 in C. elegans) in Nematoden und Pilzen als potenziellen Angriffspunkt von FP. In den meisten anderen untersuchten Spezies, welche FP-insensitiv sind, befindet sich an Position 71 ein Isoleucin. Der Nematode C. elegans kann als robustes Testsystem eingesetzt werden, um nematizide Wirkstoffe auf verschiedensten Ebenen zu analysieren. Ihre Wirksamkeit kann so, angefangen beim Lebenszyklus über die Organ- und Zellebene bis hin zu dem molekularen Wirkmechanismus, beschrieben werden und dient als Modell für pflanzenparasitische Nematoden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Fluopyram (FP) is a commercial nematicide that acts by inhibiting succinate dehydrogen-ase (SDH, complex II of the respiratory chain). This work characterizes the molecular mode of action of FP by monitoring the effects of sublethal and lethal FP doses on the life-cycle and cellular effects of the free-living nematode C. elegans. After establishing appropriate assays for FP treatment (1-50 ppm), it was found that FP inhibits the development of C. elegans and other free-living nematodes in a concentra-tion-dependent manner. In C. elegans, the critical concentration during permanent FP incubation is ≥5 ppm for embryogenesis (cuticular defects), and ≥2 ppm for larval devel-opment (decelerated) to the fertile adult animal (reduced progeny). At higher FP concen-trations inhibition of embryonic development occurs in a concentration-dependent man-ner early (before gastrulation) or later (during morphogenesis) stages. High FP concentra-tions also lead to an arrest of the larval development or the appearance of sterile, adult animals with an altered cuticle-morphology. In pulse experiments, the C. elegans embryo and the L1 larva tolerate FP concentrations of 10 ppm for 8 min and 4 days, respectively. FP is administered via bacterial feeding and does not appear to exert its effect solely by food intake. As FP crosses the eggshell of the C. elegans embryo, it is likely to penetrate directly into the cuticle of larvae and adult animals. Support for this hypothesis comes from the observation that cuticle-mutants, which are FP-hypersensitive, as well as FP-treated WT worms, both exhibit similar aberrant locomotion. The C. elegans mev-1 mutant, which carries a point mutation in the ubiquinone binding pocket of SDH (G71E in the SDHC subunit), and newly isolated mutants (e. g. mutation of the complex I of the electron transport chain) in a mutagenesis screen are resistant to FP concentrations up to 10 ppm. The mev-1 mutant can probably compensate the effect induced by FP treatment partially by hyperfusion of the mitochondria since the FP-treated wild-type shows fragmented mitochondria. A phylogenetic comparison of the amino acid sequences of the SDHC subunit, which are part of the ubiquinone-binding site, shows a conserved glycine (position 71 in C. elegans) in nematodes and fungi as a probable target of FP. In most other investigated species, which are FP-insensitive, an isoleucine is found at position 71. Overall, the results of the work presented here demonstrate that the nematode C. elegans can be utilized as a model for plant-parasitic nematodes at various levels. Their molecular mechanism of action and efficacy can be tested on the life-cycle, down to the level of organs and cells. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Vogt, Theresa theresa-vogt@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-80276
Date:	8 May 2017
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institut für Entwicklungsbiologie
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Caenorhabditis elegans, Fluopyram, Nematizid German Caenorhabditis elegans, Fluopyram, nematicide English
Date of oral exam:	4 July 2017
Referee:	Name Academic Title Roth, Siegfried Prof. Dr. Kroiher, Michael PD Dr. Bossinger, Olaf Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8027