Universität zu Köln

Hilgers, Elke Jana Andrea (2017). Untersuchungen zur physiologischen Rolle des Xylulose-5-phosphat/Phosphat-Translokators in Arabidopsis thaliana Mutanten mit Defekten im primären und sekundären Metabolismus. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der XPT ist als single-copy Gen nahezu ubiquitär in Arabidopsis thaliana exprimiert und es wird für ihn bisher eine Rolle in der Verknüpfung von cytosolischem OPPP mit dem plastidären OPPP bzw. RPPP angenommen (Eicks et al., 2002). Eine bereits im Vorfeld dieser Arbeit generierte und untersuchte XPT knockout Mutante (xpt-1) offenbarte einen leichten Phänotyp während der generativen, nicht aber während der vegetativen Phase der Entwicklung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktion des XPT in Stoffwechsel- und Entwicklungsprozessen von A. thaliana durchgeführt. Hierzu wurde (1) ein zusätzliches Mutantenallel isoliert und gemeinsam mit amiRNA:XPT-Pflanzen auf phänotypische Gemeinsamkeiten zu xpt-1 hin untersucht. Der generative Phänotyp von xpt-1 konnte jedoch anhand der unabhängigen xpt-Mutanten nicht bestätigt werden. (2) Durch Kreuzung von xpt-1 mit Mutanten anderer plastidären Phosphat-Translokatoren sowie des Stärkeanabolismus wurden Mehrfachmutanten hergestellt, um die Konsequenz eines kombinierten Funktionsverlusts zu studieren. Hierbei resultierte insbesondere der kombinierte Funktionsverlust von XPT mit TPT in einer starken Wachstumsinhibition und einer verminderten Photosyntheseleistung, die auf einer erhöhten Grundfluoreszenz (F0) basierte und daher als „Hoch-Chlorophyll-Fluoreszenz“ (HCF)-Phänotyp bezeichnet wird. Beide Phänotypen waren klar ersichtlich unter Hochlicht (HL) Bedingungen, aber abwesend unter Schwachlicht (LL) Bedingungen. Die Phänotypen der tpt/xpt Doppelmutante erinnerten stark an die der adg1-1/tpt-2 Doppelmutante. Daher wurde (3) überprüft, ob die mechanistischen Grundlagen zur Entstehung des HCF-Phänotyps in beiden Doppelmutanten identisch sind. Immunoblotanalysen zu Photosynthese-assoziierten Proteinen offenbarten eine stark verringerte Abundanz plastom- und kernkodierter Proteine mit Ausnahme der LHC. Ähnliches wurde bereits für adg1-1/tpt-2 beschrieben. Im Gegensatz zu adg1-1/tpt-2 konnte für tpt/xpt die Beteiligung von Chlororespiration und freier LHCs als Ursache des HCF-Phänotyps ausgeschlossen werden. (4) In adg1-1/tpt-2 konnte ein Mangel an Kohlenhydraten als primäre Ursache für den Wachstums- und Photosynthesephänotyp identifiziert werden. Eine Analyse der diurnalen Gehalte an Stärke, löslichen Zuckern und Aminosäuren implizierte keine großen Limitationen im C- und N-Metabolismus in tpt/xpt, dennoch führte eine exogene Zufuhr von Saccharose oder Glutamin zu einer partiellen Rettung des Wachstumsphänotyps. Wahrscheinlich können im Cytosol von tpt/xpt Triosephosphate (TP) nur glycolytisch generiert werden. Dadurch könnte eine verringerte Verfügbarkeit von TP zu Limitationen in der Aminosäurebiosynthese und dadurch im Wachstum bedingen. (5) Des Weiteren wurde die Rolle des XPT für die Lebensfähigkeit von adg1-1/tpt-2 durch Generierung einer Dreifachmutante überprüft. Die resultierende adg1 1/tpt 2/xpt 1 Dreifachmutante besitzt einen letalen Phänotyp, der durch Anzucht auf Suc überwunden werden kann. Daneben wurde (6) auch eine Beteiligung des XPT an der Viabilität von cue1-6/ppt2-1 überprüft. Eine cue1-6/ppt2-1/xpt-1 Dreifachmutante war jedoch weiterhin lebens- und reproduktionsfähig. Die erhaltenen Daten der vorliegenden Arbeit implizieren vor allem eine Funktion des XPT im Export von TP. Daten aus der Arbeitsgruppe von K.-J. Dietz weisen auf eine direkte oder auch indirekte Beteiligung von TP in der Lenkung von Stoffwechselwegen sowie Signalkaskaden hin. Dies wird in Hinblick auf eine Beteiligung des XPTs diskutiert. Zusammengefasst weisen die erhaltenen Ergebnisse auf eine zum TPT teils redundante aber auch vielschichtigere als von Eicks et al. (2002) vorgeschlagene Rolle des XPT im Stoffwechselgeschehen hin.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language As a single-copy gene the XPT is ubiquitously expressed in Arabidopsis thaliana and its proposed role is to connect the cytosolic with the plastidic OPPP or RPPP in chloroplasts (Eicks et al., 2002). A previously generated and analysed XPT knockout mutant (xpt-1) showed a mild phenotype only in the generative, but not the vegetative phase of development. In the present study the function of the XPT in metabolic and developmental processes of A. thaliana was thoroughly investigated. Therefore (1) an additional XPT mutant allele was isolated and examined together with amiRNA:XPT plants for phenotypic similarities with xpt-1. However, the generative phenotype of xpt-1 could not be confirmed with these independent approaches. (2) Crosses of xpt-1 with mutants defective in other plastidic phosphate translocators or starch metabolism were generated to study the consequences of a combined impairment in their functions. In particular tpt/xpt double mutants exhibited in a strong growth retardation and impaired photosynthesis. The latter was accompanied by a “high-chlorophyll-fluorescence” (HCF)-phenotype in the dark-adapted state. Both phenotypes were evident when the plants were grown under high light conditions, but were absent in low light-grown plants. The phenotypes of tpt/xpt resembled strongly those of adg1-1/tpt-2. (3) It was further investigated whether or not the HCF phenotype of both double mutants had a common mechanistic basis. Similar to adg1-1/tpt-2 a decrease in selected nuclear- and plastom-encoded photosynthesis-associated proteins was observed on immunoblots. In contrast to adg1-1/tpt-2, chlororespiration seemed not to be involved in the HCF of tpt/xpt. (4) Neither the analyses of diurnal carbohydrate contents nor determinations of amino acid levels revealed any large limitations in C- and N-metabolism in the tpt/xpt double mutant. However, the growth phenotype of tpt-2/xpt-1 could be partially rescued by exogenously supplied sucrose or glutamine. In case that TP can only be generated glycolytically in the cytosol of tpt/xpt, it is likely that the availability of TP and downstream metabolites limit the rate of amino acid biosynthesis and with it probably growth. (5) The role of the XPT in the viability of adg1-1/tpt-2 was investigated in a adg1-1/tpt-2/xpt-1 triple mutant. This triple mutant was lethal when grown on soil, but could be rescued on agar plates supplemented with sucrose. Finally (6) a possible participation of the XPT in the viability of a cue1-6/ppt2-1 double mutant was analyzed. However, the resulting triple mutant was still viable and able to reproduce. The data obtained in the present work indicate a function of XPT in an additional export of TP from the plastids. As has been shown by the group of K.-J. Dietz, TP might also trigger signal cascades involved in the short-term response to high light treatment. This is also discussed in the present study with regard to the role of the XPT. Taking together the data of the present study indicate a partically redundant function of XPT and TPT, but an even more complex role for XPT in metabolic processes than proposed by Eicks et al. (2012). English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hilgers, Elke Jana Andrea ehilgers@gmx.net UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-80607
Date:	2017
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Plastidäre Phosphat-Translokatoren, Photosynthese, Zuckerstoffwechsel German Plastidic phosphate translocators, photosynthesis, sugar metabolism English
Date of oral exam:	4 July 2017
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf-Ingo Prof.Dr. Bucher, Marcel Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8060