Universität zu Köln

Mylonas, Konstantinos (2018). Elucidating the molecular mechanisms conferred by the histone chaperone FACT. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The conserved and essential histone chaperone FACT (Facilitates Chromatin Transcription) reorganises nucleosomes during DNA transcription, replication and repair and ensures both, efficient elongation of polymerases and nucleosome integrity. In mammalian cells, FACT is a heterodimer, consisting of SSRP1 and SUPT16. Although the genetics and biochemistry of FACT are relatively well understood, it is not known whether it confers cell-type dedicated functions. However, genome-wide expression analyses across cell and tissue types implicate a role of FACT in maintaining an undifferentiated state. Here, we show that in mouse embryonic stem cells (mESCs), depletion of FACT leads to up-regulation and alternative splicing of pro-proliferative genes and key pluripotency factors concomitantly with hyper-proliferation of mES cells. Additionally, genes involved in neurogenesis are de-repressed in the absence of FACT, leading to faster progression of neuronal differentiation. To understand the role of FACT in regulating transcription at these loci, we performed MNase digestion of chromatin coupled to deep sequencing (MNase-seq) and Nascent Elongating Transcript Sequencing (NET-seq). Genes up-regulated upon FACT depletion, are characterised by loss of MNase-resistance just upstream of the transcription start site, suggesting that nucleosome deposition by FACT dampens gene expression. Finally, in combination with the NET-seq data, we show that this FACT-dependent nucleosome distribution at the promoter region is closely associated with strong uni-directionality of RNA Polymerase II towards the coding region. Taken together, FACT promotes Pol II governing through nucleosome deposition and thus enables maintenance of an undifferentiated state.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Das konservierte und essentielle Histon-Chaperon FACT (Facilitates Chromatin Transcription) reorganisiert Nukleosomen während der DNA-Transkription, Replikation und Reparatur und sorgt sowohl für eine effiziente Bewegung der Polymerasen durch das Chromatin als auch für die Nukleosomenintegrität. In Säugetierzellen formt FACT ein Heterodimer, bestehend aus SSRP1 und SUPT16. Obwohl die Genetik und Biochemie von FACT relativ gut verstanden sind, ist es nicht bekannt, ob es zelltypische und spezifische Funktionen verleiht. Allerdings implizieren genomweite Expressionsanalysen über Zell- und Gewebetypen eine Rolle von FACT bei der Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Zustands. Hier zeigen wir, dass in murinen embryonalen Stammzellen (mESCs) die Depletion von FACT zu einer Hochregulierung und einem alternativen Spleißen von proproliferativen Genen und Genen kommt, die entscheidend für die Pluripotenz sind. Gleichzeitig sind viele Gene auch mit der Hyperproliferation von mES-Zellen assoziiert. Weiterhin sind andere Genen, die an der Neurogenese beteiligt sind, in Abwesenheit von FACT hochreguliert, was zu einer schnelleren Progression der neuronalen Differenzierung führt. Um die Rolle von FACT bei der Regulierung der Transkription an diesen Loci zu verstehen, haben wir MNase-Verdauung von Chromatin, gekoppelt an Micrococcal Nuclease-sequenzierung (MNase-seq) und ‚Nascent Elongating Transcript-Sequencing’ (NET-seq), durchgeführt. Bei der zweiten Methode wird die Position der RNA Polymerase nukleotidgenau und genomweit wiedergegeben. Genen, die nach der Depletion von FACT hochreguliert sind, zeichnen sich durch einen Verlust der MNase-Resistenz 5’ der Transkriptionsstartstelle aus, was darauf hindeutet, dass die Nukleosomenablagerung durch FACT an dieser Stelle die Genexpression dämpft. Schließlich zeigen wir in Kombination mit den NET-seq-Daten, dass diese FACT-abhängige Nukleosomenverteilung an der Promotorregion eng mit einer starken Unidirektionalität der RNA-Polymerase II in Richtung der kodierenden Region assoziiert ist. Zusammengenommen läßt sich sagen, dass FACT die Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Zustands durch die Positionierung von Nukleosomen und Regulation von RNA Pol II beeinflusst. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Mylonas, Konstantinos cmylonas@age.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-81781
Date:	2018
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Transcription, chromatin, stem cells English
Date of oral exam:	15 November 2017
Referee:	Name Academic Title Bayer, Andreas Prof. Dr. Tessarz, Peter Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/8178