Globale Analyse von Stickstoff-Metabolismus und Stickstoff-Kontrolle in Corynebacterium glutamicum

Bendt, Anne K. (2002). Globale Analyse von Stickstoff-Metabolismus und Stickstoff-Kontrolle in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum hat für die industrielle Produktion von Aminosäuren wie L-Glutamat und L-Lysin eine große Bedeutung. Während der Fermentationsprozesse werden optimale Wachstumsbedingungen für das Bakterium geschaffen; im Gegensatz dazu sind im natürlichen Habitat, dem Boden, Stress und Nährstoff-Limitation die Regel. In dieser Arbeit wurde die Reaktion von C. glutamicum auf Stickstoff- Limitation global analysiert. Adaptationsmechanismen an Stickstoff-Limitation, die über die Regulation der Genexpression kontrolliert werden, wurden mit Gesamtgenom-Microarrays untersucht. Über diesen Ansatz konnte eine Vielzahl von Genen detektiert werden, deren Expression unter Stickstoff-Limitation signifikant verstärkt war. Unter ihnen befanden sich Gene, deren Genprodukte in die (Methyl- )Ammonium-Aufnahme involviert sind (amt, amtB), Gene, die für den Glutamat- spezifischen ABC-Transporter kodieren (gluABC), Gene, die für Proteine der Stickstoff-Kontrolle kodieren (glnD, glnE, glnK) sowie Gene, die für Stickstoff-assimilierende Enzyme wie der Glutamat-Dehydrogenase (gdh), der Glutamin-Synthetase I (glnA), die GOGAT (gltBD) und die Urease (ureABCDE) kodieren. Adaptationsmechanismen, die über die Regulation der Proteinmenge kontrolliert werden, wurden mit der zweidimensionale Gelelektrophorese (2- DE) untersucht. Die Analysen konzentrierten sich dabei auf die cytoplasmatischen Proteine, von denen mehr als 1200 über 2-DE analysierbar sind. Interessanterweise waren die Proteine, deren Genexpression unter Stickstoff-Hunger signifikant induziert war, im Proteom N-gehungerter Zellen nicht verstärkt vorhanden, was auf nur geringfügige Änderungen der Proteinmengen hinweist. Um die Bedeutung von Phosphorylierungsprozessen zu analysieren, wurden Methoden zur Detektion phosphorylierter Proteine etabliert. Bis zu 90 Phosphoproteine konnten durch in vivo-Markierung mit [33P] und durch Immunfärbung mit Phosphoserin-spezifischen Antikörpern detektiert werden. Der Großteil von ihnen wurde über MALDI-TOF-MS identifiziert, so dass eine Karte des Phosphoproteoms von C. glutamicum erstellt werden konnte. Zusätzlich wurde untersucht, welchen Einfluss Stickstoff-Limitation auf das Phosphoproteom hat.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

The Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum is one of the most important microorganism involved in the industrial production of amino acids such as L-glutamate and L-lysine. Whereas optimal growth conditions are maintained during fermentation processes, stress and starvation are the rule in the natural habitat of this bacterium, the soil. In this study, the reaction of C. glutamicum to nitrogen starvation was investigated by global analyses. Adaptation to nitrogen starvation that occur via regulation of gene expression were monitored using whole-genome microarrays. By this approach, various genes were detected as being significantly up-regulated in response to nitrogen starvation. Among them are genes encoding proteins involved in (methyl-)ammonium uptake (amt, amtB), genes encoding the glutamate-specific ABC transporter (gluABC), genes coding for proteins of nitrogen control (glnD, glnE, glnK) as well as genes encoding nitrogen assimilating enzymes such as glutamate dehydrogenase (gdh), glutamine synthetase I (glnA), GOGAT (gltBD) and the urea-degrading enzyme urease (ureABCDE). Adaptation occuring via regulation of protein abundance were studied by two- dimensional gel electrophoresis (2-DE). This work focussed on the analysis of cytoplasmic proteins, with more than 1200 of them being analyzable by 2- DE. Interestingly, the abundance of proteins, whose gene expression has been shown to be up-regulated under nitrogen starvation, remained unchanged in the proteome of nitrogen starved cells, indicating only subtile changes in protein synthesis. To elucidate the role of phosphorylation processes, methods for the detection of phosphorylated proteins were established. By in vivo radiolabeling using [33P]-phosphoric acid and by immunostaining with phosphoserine-specific antibodies, up to 90 phosphoproteins were detected. Most of them were identified by MALDI-TOF-MS and a phospho-proteome map of C. glutamicum could be created. Additionally, the influence of nitrogen deprivation on the phospho-proteome was investigated.

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