Universität zu Köln

Lisinski, Ivonne (2003). Untersuchungen zum Recycling der Glucosetransporter GLUT4, GLUT6 und GLUT8 in Adipocyten. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

1. Identifizierung und Charakterisierung eines neuartigen GLUT4-Bindeproteins (p49) : Der Glucosetransporter 4 (GLUT4) wird in insulinsensitiven Geweben, wie Fettzellen (Adipocyten) und Muskelzellen exprimiert und vermittelt dort den insulinstimulierten Glucosetransport. GLUT4 recycelt zwischen intrazellulären Kompartimenten und der Plasmamembran. Um neue regulatorisch wirkende Komponenten des GLUT4-Recyclings zu identifizieren, wurde das Hefe-Two-Hybrid-System verwendet. Dabei diente der GLUT4-N-Terminus als Köder (bait) und eine Adipocyten-cDNA-Bank als Beute (prey). Es konnte ein neuartiges 49 kDa Coiled-coil-Protein (p49) isoliert und partiell charakterisiert werden, das in vitro und in vivo an ein 7 Aminosäuren umfassendes Bindemotiv (QIGSEDG) im GLUT4-N-Terminus bindet. Das basische p49-Protein (pI 9.5) enthält vermutlich drei Coiled-coil-Domänen (Lupas-Algorithmus) im N-Terminus sowie eine Konsensussequenz für die Bindung von SH3-Proteinen (PxxP) im C-Terminus. Das p49-Protein findet sich in Säugern (Mensch, Maus, Ratte, Rind und Schaf) und die p49-mRNA konnte in insulinsensitiven Geweben wie Muskelzellen und Fettzellen nachgewiesen werden. Durch die Überexpression von p49-Konstrukten, die eine GLUT4-bindende N-terminale Hälfte von p49 enthalten (Volllängen p49, p49-N (Aminosäuren 1-216, 25kDa) und p19 (Aminosäuren x-y, 19 kDa) in primären Ratten-Adipocyten, wird die GLUT4-Expression um ca. 50% gehemmt. Der gleiche Effekt, d.h. die Reduktion der GLUT4-Expression, wird erreicht, wenn das p49-Bindemotiv im GLUT4 ausgeschaltet wird. P49 ist mit GLUT4 in primären Ratten-Adipocyten kolokalisiert und zeigt zusätzlich eine Kolokalisation mit dem ER-(endoplasmatisches Retikulum)-Markerprotein Calnexin. Die biologische Funktion von p49 in Adipocyten ist unbekannt. Versuche zur Bestimmung des turn-overs von GLUT4 mit dem Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid inplizieren jedoch eine Rolle von p49 bei der intrazellulären Sortierung von GLUT4. 2. Charakterisierung der beiden GLUT-Transporter, GLUT6 und GLUT8 : Die subzelluläre Verteilung der beiden erst kürzlich klonierten Glucosetransporter GLUT6 und GLUT8 konnte durch die Expression von Hämagglutinin-(HA)-epitopmarkierten GLUTs in transfizierten Ratten-Adipocyten bestimmt werden. In unstimulierten Adipocyten waren HA-GLUT6 und HA-GLUT8, genau wie HA-GLUT4, in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert. Im Gegensatz dazu führte die Mutation eines Dileucin-Motivs (LL-Motiv) in den N-Termini von HA-GLUT6/8 zu einer konstitutiven Zelloberflächenexpression beider Transporter. Durch Blockade der Endocytose durch Koexpression einer dominant-negativen Dynamin-(K44A)-Mutante konnte nachgewiesen werden, dass beide Transporter in Adipocyten einem kontinuierlichen Recycling unterliegen. Im Gegensatz zum HA-GLUT4 zeigten HA-GLUT6/8 jedoch keine Translokation zur Plasmamembran, wenn die Zellen mit Insulin oder anderen Stimuli (Phorbolestern, Hyperosmolarität, Vasopressin, Isoproterenol/Adenosindeaminase, GTPgammaS und Oxytocin) behandelt wurden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language 1. Identification and characterisation of a Novel GLUT4-binding Protein (p49) : Type-2 Diabetes mellitus is characterized by an inadequate glucose uptake and utilization in fat and muscle. The main contribution of insulin-dependent glucose uptake in insulin-sensitive cells is provided by GLUT4. Insulin leads to a rapid and reversible translocation of GLUT4 from an intracellular pool to the plasma membrane. To identify new regulatory components involved in the recycling of GLUT4, we have used the yeast-two-hybrid system to isolate GLUT4-binding proteins from a rat fat cell cDNA library. We have isolated and characterized a new coiled-coil-domain-containing 49 kDa protein (p49) that specifically interacts with GLUT4. Confocal immunofluorescence microscopy of myc-p49 transfected rat adipocytes showed colocalisation of p49 with GLUT4, and also with the ER-resident calnexin. Overexpression of p49 reduces the cell surface expression of GLUT4 but not of GLUT8. Similarly, cell surface expression of a 49-binding-deficient GLUT4 mutant (E11Q, D12N, ED/QN) is also reduced. Kinetic analysis of the HA-GLUT4 protein synthesis indicates a possible role of p49 in intracellular synthesis and/or processing of GLUT4. We postulate that p49 is involved in GLUT4 biosynthesis/sorting. 2. Recycling of GLUT6 and GLUT8 in rat adipose cells: The subcellular recycling of the two mammalian glucose transporters, GLUT6 and GLUT8, was analysed by expression of haemagglutinin (HA)-epitope-tagged GLUTs in transiently transfected primary rat adipose cells. Similar to HA-GLUT4, both transporters, HA-GLUT6 and HA-GLUT8, were retained in intracellular compartments in non-stimulated cells. In contrast, mutation of the N-terminal dileucine motifs in both constructs led to constitutive expression of the proteins on the plasma membrane. Likewise, when endocytosis was blocked by co-expression of a dominant-negative mutant of the dynamin GTPase, wild-type HA-GLUT6 and HA-GLUT8 accumulated on the cell surface. However, in contrast with HA-GLUT4, no translocation of HA-GLUT6 and HA-GLUT8 to the plasma membrane was observed when the cells were stimulated with insulin, or other potential GLUT4 stimuli. Thus GLUT6 and GLUT8 appear to recycle in a dynamin-dependent manner between internal membranes and the plasma membrane in rat adipose cells, but are unresponsive to stimuli that induce translocation of GLUT4. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Lisinski, Ivonne acc22@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-9151
Date:	2003
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Recycling, Glucosetransporter, GLUT4, GLUT6, GLUT8 Adipocyten German Recycling, Glucose transporter, GLUT4, GLUT6, GLUT8 Adipocytes English
Date of oral exam:	2 July 2003
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Professor UNSPECIFIED
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/915