In vivo Charakterisierung der 4-Cumarat:CoA Ligase-Familie in Arabidopsis thaliana

Hamberger, Björn (2003). In vivo Charakterisierung der 4-Cumarat:CoA Ligase-Familie in Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Ziel des Projekts war die Aufschlüsselung der in vivo-Funktionen der drei bekannten A. thaliana 4-Cumarat:CoA Ligasen. In silico Untersuchungen führten zur Entdeckung einer weiteren, wahtscheinlich letzten Isoform, At4CL4. Nach phylogenetischen und genomischen Analysen konnte At4CL4 den Klasse I-4CLs zugeordnet werden und ein Modell wurde vorgeschlagen, das die Evolution der At4CL-Familie beschreibt. At4CL4 wurde heterolog exprimiert und enzymkinetisch als bona fide 4CL charakterisiert mit der besonderen Fähigkeit in vitro Sinapinsäure zu aktivieren. Der At4CL4-katalysierten Aktivierung von Sinpinsäure bzw. Ferulasäure könnte eine Rolle im Stoffwechselweg zu den Sinpat-Derivaten oder Ligninvorstufen zukommen. Auf RT-PCR Ebene wurde die mRNA-Akkumulation der At4CLs untersucht. At4CL4 zeigte ein Muster grundsätzlich ähnlich dem der At4CL1 und der At4CL2 Dieses lässt eine in vivo Funktion der At4CL4 assoziiert mit der Synthese von Ligninvorstufen und anderen phenolischen Verbindungen erwarten. Neben der bereits existierenden At4CL1-Nullmutante wurde zu jedem weiteren Mitglied der At4CL-Familie mindestens eine weitere Linie isoliert, molekularbiologisch und biochemisch charakterisiert. In methanolischen Extrakten löslicher Sekundärmetabolite aus Wurzeln der At4CL1 Mutante wurde Akkumulation einer Verbindung mit einem UV-Spektrum ähnlich dem des Cumarins nachgewiesen In den HPLC-Profilen der At4CL3-Nullmutante wurde die Reduktion, nicht aber vollständiges Fehlen von Flavonoiden nachgewiesen. Die Ausprägung des At4CL3-Nullmutanten-Phänotyps war in verschiedenen Organen und Entwicklungsstufen unterschiedlich stark. Auch konnte keine UV- induzierbare Akkumulation von Flavonoiden in der At4CL3-Nullmutante gezeigt werden. Eine Funktion der At4CL3 kann daher in in der Aktivierung von Flavonoid-Vorstufen in jungen Pflanzen und nach UV-Perzeption bestehen. Um die funktionellen Redundanzen zu überwinden, wurden multiple Nullmutanten der At4CLs mit Mutanten der Gene AtCHS und AtF5H generiert, um weitere strategische Punkte des Metabolitenflusses abzudecken. Morphologische und biochemische Charakterisierung ausgewählter Mutanten zeigte, dass ein homozygoter Defekt von At4CL1 und At4CL2 zum Stagnieren der pflanzlichen Entwicklung im Alter von 5-6 Wochen führte. In HPLC-Profilen konnte hier die spezifische Akkumulation von drei Verbindungen nachgewiesen werden, die vermutlich 4-Cumarat- und Ferulat-Derivate darstellen. Daraus wurde geschlossen, dass die Funktionen von At4CL1 und At4CL2 in der Synthese von Ligninvorstufen und weiteren phenolischen Verbindungen der späten Entwicklungsstadien bestehen.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

The aim of this project was to analyze in vivo the function of the three known isoforms of A. thaliana 4-coumarate:CoA ligases (At4CLs). In silico analyses led to the discovery of a fourth isoform, At4CL4. A model describing the evolution of the At4CL-family was proposed and it was further suggested that At4CL4 completes the At4CL family. The heterologously expressed enzyme posses an unusual substrate utilization pattern. To date, At4CL4 and a recently published soybean 4CL are the only known heterologously expressed 4CLs that exhibit conversion of the exceptional substrate sinapate. The expression pattern of At4CL4 was comparable to At4CL1 and At4CL2. Together with the substrate preferrence, this suggests an association with the class I isoforms. Additionally to an existing At4CL1 knockout line, at least one stable mutant was isolated, morphologically and phenotypically characterized for every member of the At4CLs. Biochemical analysis using HPLC identified an additional peak in the soluble metabolite fraction of At4CL1 knockout line roots. The UV-was similar to that of coumarine. At4CL3 knockout lines showed a strong decrease of flavonoids, depending on age and tissue. Additionally, At4CL3 knockout lines lack UV-inducibility of the flavonoid biosynthesis. This supports the function of At4CL3 in the flavonoid biosynthesis in young plants and after UV-perception. Multiple mutants were generated by combining different single lines covering additional points in the phenylpropanoid pathway to overcome the described functional redundancies. This included crosses with kockout lines for AtCHS and AtF5H. One combination was selected for the further morphological and biochemical analysis. Homozygous double knockout lines for At4CL1 and At4CL2 were identified. They showed an arrest of growth at the developmental stage of five weeks. Three additional compounds with UV-Spectra similar to ferulate and 4-coumarate occurred specifically in the soluble secondary metabolite fractions of these lines. These results suggest a function of At4CL1 and At4CL2 in the biosynthesis of lignin precursors.

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