Universität zu Köln

Denzel, Sarah Isabella (2019). The Role of GFAT-1 in C. elegans Protein Quality Control. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The hexosamine pathway (HP) requires products from carbohydrate, amino acid, fatty acid and nucleotide metabolism to synthesize the aminosugar uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). This molecule is an essential precursor for diverse protein glycosylation reactions and the production of abundant biomolecules. Thus, many metabolic pathways can influence the HP and the HP, likewise, impacts multiple cellular processes. The first step of the HP determines the rate of UDP-GlcNAc synthesis and is catalyzed by glutamine fructose 6-phosphate aminotransferase (GFAT-1). Two important recent discoveries implicate GFAT-1 and the HP in the modulation of protein quality control (PQC). First, it was demonstrated that GFAT-1 is a transcriptional target of the unfolded protein response (UPR). Second, a boost in HP activity by gain-of-function (gof) mutations in gfat-1 itself improves PQC and prolongs life in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, it remains unclear how GFAT-1 might regulate the complex protein homeostasis machinery and in my PhD I set out to address this important question. In this study I confirmed a regulation of GFAT-1 protein during stress. In particular stress within the endoplasmic reticulum led to a strong induction of GFAT-1 expression specifically in the worm intestine. While gfat-1 gof mutations and GFAT-1 overexpression (OE) under the gfat-1 promoter protected animals from tunicamycin toxicity, it did not, however, confer general stress resistance. Despite the broad positive effect of gfat-1 gof mutations on PQC mechanisms and the strong enrichment in the cellular metabolite UDP-GlcNAc we could not detect major changes in transcriptome or proteome compared to wildtype controls. To better understand and dissect the role of GFAT-1, we generated tissue-specific GFAT-1 OE C. elegans lines. Intestinal GFAT-1 OE appeared detrimental as the animals of multiple transgenic lines were characterized by small body size and sick appearance. In contrast, the pan-neuronal and muscular GFAT-1 OE resulted in healthy worms. They exhibited an elevation in autophagic flux relative to controls. While we did, however, not observe a decrease in proteotoxicity in different tissues of nematodes with pan-neuronal GFAT-1 OE, we noticed a large, cell autonomous reduction in polyglutamine (polyQ) toxicity in C. elegans with muscle-specific GFAT-1 OE. Not only did it strongly suppress the load of polyQ aggregates but also it prevented the progressive paralysis typical for muscular protein aggregation models. Interestingly, OE of mutant enzymatic dead GFAT-1 mildly improved polyQ toxicity, 3 suggesting that the effect can be only partially attributed to UDP-GlcNAc production. To identify downstream effectors of GFAT-1 OE that mediate improved PQC we performed a GFAT-1 pulldown experiment to determine physical interactors. We then carried out a selective RNAi suppressor screen on these interactors as well as further candidate genes, using the strong motility phenotype as a readout. Among 15 identified candidates, we deemed ABCF-3 the most interesting. This protein is known to co-regulate the activation of GCN-2 kinase by uncharged tRNAs and to thereby modulate the integrated stress response (ISR). I showed that ABCF-3 associates with GFAT-1 and that the health benefits of muscular GFAT-1 OE in a polyQ model are completely dependent on ABCF-3. Furthermore, GFAT-1 OE led to a slight elevation of eIF2α phosphorylation and ATF-5 expression, which are critical hallmarks of an activated ISR. We conclude that GFAT-1 exercises its positive effects on PQC by modulation of the ISR through interaction with ABCF-3 and that this novel connection of the HP and the ISR is of particular importance in the maintenance of healthy muscle tissue.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Der Hexosamin Biosyntheseweg (HP) setzt metabolische Intermediate aus Kohlenhydrat-, Aminosäure-, Fettsäure- und Nukleotidmetabolismus um und sythetisiert den Aminozucker Uridindiphosphat-N-acetylglucosamin (UDP-GlcNAc). Dieses Molekül ist ein essentieller Baustein für diverse Proteinglykosylierungsreaktionen und für die Produktion weit verbreiteter Biomoleküle. Viele Stoffwechselwege können somit den HP beeinflussen und der HP nimmt gleichermaßen Einfluss auf zahlreiche zelluläre Prozesse. Der erste enzymatische Schritt des HP bestimmt die Geschwindigkeit der Produktion von UDP-GlcNAc und wird durch Glutamin-Fructose-6-phosphataminotransferase (GFAT-1) katalysiert. Zwei wichtige aktuelle Entdeckungen zeigen zudem, dass GFAT-1 und der HP in die Modulation der Proteinqualitätskontrolle (PQC) eingebunden sind. Zum einen wurde gezeigt, dass GFAT-1 ein transkriptionelles Zielgen in der Antwort auf ungefaltete Proteine (UPR) im endoplasmatischen Retikulum (ER) ist. Zum anderen erhöhen funktionsverstärkende (gof) Mutationen in gfat-1 die HP Aktivität und verbessern dadurch die PQC und verlängern die Lebensspanne des Fadenwurms Caenorhabditis elegans (C. elegans). Es blieb jedoch weiterhin unklar, wie GFAT-1 die komplexen Systeme zur Erhaltung der Proteinhomöostase beeinflusst. Ziel meiner Doktorarbeit war es diese wichtige Frage zu beantworten. Mit den Ergebnissen dieser Studie konnte ich bestätigen, dass die Expression von GFAT-1 durch Stress reguliert ist. Insbesondere ER-Stress führte zu einer starken Induktion von GFAT-1 im Darm der Würmer. Obwohl gfat-1 gof Mutationen und GFAT-1-Überexpression (OE) unter Kontrolle des gfat-1 Promotors vor Tunicamycin Toxizität schützten, verlieh dies keine allgemeine Stressresistenz. Trotz der umfassenden positiven Wirkung von gfat-1 gof Mutationen auf PQC-Mechanismen und der starken Anreicherung des zellulären Stoffwechselprodukts UDP-GlcNAc konnten wir im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen keine größeren Veränderungen des Transkriptoms oder Proteoms nachweisen. Um die verschiedenen Funktionen von GFAT-1 besser zu verstehen stellte ich gewebespezifische GFAT-1 OE C. elegans Linien her und untersuchte diese. Die OE von GFAT-1 im Darm schien hierbei nachteilig zu sein, da auch die Herstellung mehrerer transgener Linien nur zu Tieren mit geringer Körpergröße und krankem Aussehen führte. Im Gegensatz dazu waren transgene Würmer mit neuronaler oder muskulärer GFAT-1 OE augenscheinlich gesund und nicht von wildtypischen Würmern zu unterscheiden. Gegenüber den Kontrollen zeigten sie eine leichte 5 Erhöhung des Autophagie Prozesses. Im Falle der neuronalen GFAT-1 OE führte dies nicht zu einer Abnahme der Proteotoxizität in verschiedenen untersuchten Geweben. Im Gegensatz dazu konnte ich eine starke zellautonome Reduktion der Polyglutamin (polyQ)-Toxizität in Nematoden mit muskel-spezifischer GFAT-1 OE feststellen. Nicht nur war die Zahl der polyQ Aggregate stark reduziert, sondern es wurde auch die für Protein-aggregationsmodelle im Muskel typische, progressive Lähmung verhindert. Interessanterweise verbesserte die OE von mutiertem GFAT-1 ohne enzymatische Aktivität die PolyQ Toxizität noch in geringem aber signifikantem Maße, was darauf hindeutet, dass der Effekt der GFAT-1 OE nur teilweise auf die UDP-GlcNAc Produktion zurückzuführen ist. Im Folgenden führte ich Ko-Immunpräzipitation durch um mögliche Bindungspartner von GFAT-1 zu identifizieren. Anschließend testete ich die Abhängigkeit der beobachteten PQC Verbesserung von diesen GFAT-1 Interaktoren und von weiteren Kandidaten. Hierfür führte ich einen selektiven RNAi Screen mit Motilitätsverbesserung als kritischem Phänotyp durch. Aus den 15 identifizierten Kandidaten wählten wir ABCF-3 zur weiteren Analyse aus. Es ist bekannt, dass dieses Protein die Aktivierung der GCN-2 Kinase durch ungeladene tRNAs reguliert und dadurch die integrierte Stressantwort (ISR) moduliert. Ich konnte zeigen, dass ABCF-3 ein mit GFAT-1 assoziiert und dass die gesundheitlichen Vorteile der muskulären GFAT-1 OE im PolyQ-Modell vollständig von ABCF-3 abhängen. Darüber hinaus führte GFAT-1 OE zu einer leichten Erhöhung der eIF2α Phosphorylierung und der ATF-5 Expression, beides wichtige Merkmale einer aktivierten ISR. Zusammenfassend schließen wir, dass GFAT-1 seine positive Wirkung auf die PQC durch direkte Interaktion mit ABCF-3 und resultierender Modulation der ISR ausübt und dass diese bisher nicht beschriebene Verbindung von HP und ISR für die Erhaltung von gesundem Muskelgewebe von besonderer Bedeutung ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Denzel, Sarah Isabella sarahdenzel.iam@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-93868
Date:	2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Hexosamine pathway, gfat-1, UDP-GlcNAc, protein quality control, integrated stress response, polyglutamine, C. elegans UNSPECIFIED
Date of oral exam:	13 February 2019
Referee:	Name Academic Title Antebi, Adam Prof. Dr. Trifunovic, Aleksandra Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/9386