Die Rolle der Interaktion des zellulären Koaktivators p300 mit den E2- und E6-Proteinen von Papillomviren bei der Regulation der viralen Genexpression

Müller, Andreas (2003). Die Rolle der Interaktion des zellulären Koaktivators p300 mit den E2- und E6-Proteinen von Papillomviren bei der Regulation der viralen Genexpression. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Papillomviren (PV) infizieren die Basalzellen der Haut oder Schleimhaut und induzieren dort die Bildung gutartiger Tumoren, die bei Infektion mit gewissen PV-Typen maligne entarten können. Das humane PV Typ 8 (HPV8) gehört zu den Hochrisiko-PV, die mit der seltenen Hautkrankheit Epidermodysplasia verruciformis assoziiert sind. In dieser Studie wurde die Rolle des zellulären Koaktivators p300 bei der Regulation der HPV8-Genexpression durch das virale E2- und E6-Protein untersucht. Hierbei wurde erstmals eine direkte Interaktion des Transkriptionsregulators E2 von HPV8 (8E2) mit p300 bewiesen. In transienten Transfektionsanalysen konnte die moderate Aktivierung des späten Promotors von HPV8 durch geringe 8E2-Konzentrationen nach Koexpression von p300 um den Faktor sieben stimuliert werden. Der Synergismus von 8E2 und p300 könnte eine Rolle bei der differenzierungsabhängigen Aktivierung der PV-Genexpression spielen, da immunhistochemische Färbungen von Hautschnitten zeigten, dass die Expression von p300 in den differenzierten oberen Epithelschichten induziert wird. Die Kooperation mit p300 blieb auch erhalten, nachdem entweder die E2-Bindestellen innerhalb der nicht-kodierenden Region von HPV8 oder die DNA-bindende Domäne (DBD) von 8E2 mutiert wurden, so dass 8E2 auch über Protein-Protein-Interaktionen an den Promotor rekrutiert werden könnte. Transiente Transfektionsanalysen demonstrierten, dass die Aktivierungsdomäne (AD) von 8E2 für den Synergismus mit p300 ausreichend und notwendig ist, obwohl sie in vitro nur schwach an p300 bindet. Die Hinge und die DBD von 8E2 interagierten vergleichsweise stärker mit p300 und deren Fusion an eine heterologe AD zeigte in transienten Transfektionsanalysen eine Beteiligung der Hinge und/oder der DBD an der Kooperation mit p300. Das Onkoprotein E6 von HPV8 (8E6) kann die 8E2- und p300-vermittelte Aktivierung weiter stimulieren. Im Gegensatz dazu führt das onkogene E6 von HPV16 (16E6), das die Schleimhaut infiziert und sehr häufig in Zervix-Karzinomen gefunden wird, zu einer starken Repression. Die gegensätzlichen Effekte der beiden E6-Proteine auf die Modulation der Transkription wurden in dieser Arbeit analysiert. Beide Proteine scheinen identisch an zwei zentrale Domänen von p300 zu binden, von denen eine innerhalb der Aminosäuren 1789-1814 liegt und mit der Binderegion von 8E2 überlappt. Das zuvor definierte TRAM-Modul von p300 (As 1770-1788), das als Interaktionsort für 16E6 vermutet wurde, war für die Bindung von 8E2, 8E6 und 16E6 nicht notwendig. Da wegen des vergleichbaren Bindemusters der beiden E6-Proteine an p300 eine kompetitive Bindung mit 8E2 als Mechanismus für die Repression durch 16E6 unwahrscheinlich erschien, wurden die transkriptionsmodulierenden Funktionen der beiden E6-Proteine näher untersucht. Für 8E6 erwies sich die C-terminale Hälfte als ausreichend für die Koaktivator-Funktion, die mit einer Bindung an p300 in vitro korrelierte. Innerhalb von 16E6 konnten zwei voneinander unabhängige Repressionsdomänen identifiziert werden. Eine befindet sich im C-Terminus, korreliert ebenfalls mit einer Bindung an p300 und benötigt zusätzlich die vier C-terminalen Aminosäuren, die als Motiv für die Bindung an PDZ-Proteine bekannt sind. Für diese Region wurde hier erstmals eine transkriptions-modulierende Funktion gezeigt. Die zweite reprimierende Funktion lokalisiert im N-Terminus, agiert nur in Gegenwart der C-terminalen Hälfte und ist unabhängig von E6-AP.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
The role of the interaction of the cellular coactivator p300 with papillomavirus E2 and E6 proteins in regulation of viral gene expression	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Papillomaviruses (PV) infect the basal cells of the skin and mucosal epithelium causing benign and malignant tumors. Human PV type 8 (HPV8) belongs to the oncogenic types specifically associated with the rare skin disease Epidermodysplasia verruciformis. In this study the role of the cellular coactivator p300 in regulation of HPV8 gene expression by the viral proteins E2 and E6 was analyzed. A direct interaction between the transcriptional regulator E2 of HPV8 (8E2) and p300 could be demonstrated for the first time. In transient transfection assays the moderate HPV8 late promoter activation by low amounts of 8E2 was stimulated up to sevenfold after coexpression of p300. The synergism between 8E2 and p300 may play a role in differentiation-dependent activation of PV gene expression, since an increased expression level of p300 during keratinocyte differentiation could be detected by immunohistochemical staining of skin sections. Cooperativity was still observed after mutating either the E2 recognition sites within the non-coding region of HPV8 or the DNA binding domain (DBD) of 8E2, indicating that 8E2 may be recruited to the promoter via protein-protein interaction. Transient transfection assays revealed that the activation domain (AD) of 8E2 is necessary and sufficient for cooperative activation with p300 although the AD only weakly binds to p300 in vitro. A stronger interaction was observed with the hinge and the DBD of 8E2. Moreover, fusing this part of 8E2 to a heterologous AD showed that the hinge and/or the DBD may contribute to the cooperativity with p300. The E6 oncoprotein of HPV8 (8E6) further stimulates the 8E2 and p300 mediated activation. In contrast the oncogenic E6 of HPV16 (16E6), which infects the mucosa and is often found in cervical carcinomas, strongly represses gene expression mediated by 8E2 and p300. In this work the opposite effects of 8E6 and 16E6 were analyzed. Both proteins seem to bind two central domains of p300, with one binding domain identified here between aa 1789-1814. 8E2 binds to similar regions as the two E6 proteins. The previously defined TRAM-motif of p300 (aa 1770-1788), which was proposed to function as an adapter modul for 16E6, was not necessary for binding of 8E2, 8E6 or 16E6. Since E6-proteins revealed a comparable binding pattern to p300, a competition for binding to p300 with 8E2 seemed unlikely to be the mechanism of repression by 16E6. Therefore the transcriptional modulation functions of the two E6 proteins were investigated in more detail. The c-terminal part of 8E6 was sufficient for coactivator function, which correlated with a binding to p300 in vitro. Within 16E6 two independent repression domains were identified. The first localizes in the c-terminal part. It depends on binding to p300 and on the c-terminal four amino acids, which have been identified as a binding domain for PDZ-proteins. This implies that this motif may play a novel role in E6 modulation of transcription. The second repression domain is within the n-terminal part. It only works in presence of the c-terminus and does not depend on E6-AP.

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