Universität zu Köln

Beckers, Gabriele (2004). AmtR - ein globaler Repressor der Stickstoffkontrolle in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

AmtR - ein globaler Repressor der Stickstoffkontrolle in Corynebacterium glutamicum Das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum wird in der Industrie zur Synthese von Aminosaeuren - vornehmlich Glutamat und Lysin - eingesetzt und gewann daher in den letzten Jahren an großer biotechnologischer Bedeutung. Zur Herstellung von Aminosaeuren ist eine gute Stickstoff-Versorgung der Zelle essentiell. C. glutamicum ist in der Lage verschiedenen Stickstoffquellen, wie z. B. Ammonium, Harnstoff, Glutamin und Glutamat, aufzunehmen und zu verwerten. Bakterien adaptieren sich an die jeweilig vorherrschenden Bedingungen durch Synthese spezifischer Transporter und assimilierender Enzyme. Regulatorische Prozesse auf Expressions- sowie Aktivitaetsebene vermeiden einen unnoetigen Energieverbrauch der Zellen z. B. durch futile cycling und werden unter dem Begriff Stickstoffkontrolle zusammengefaßt. Unter Stickstoffueberschuß reprimiert der Regulator AmtR die Expression des amt-soxA-ocd-Operons, des amtB-glnK-glnD-Operons, des gltBD-Operons, sowie der Gene glnA, crnT und NCgl1099. Innerhalb dieser Arbeit sollte das gesamte AmtR-Regulon genauer charakterisiert werden. Mit Hilfe von Microarrays konnten die Auswirkungen einer amtR-Deletion auf das gesamte Transkriptom untersucht werden. Weiterhin wurden das gesamte Genom von C. glutamicum mit einem bioinformatischen Ansatz nach putativen Bindesequenzen in den fuer AmtR durchsucht. Die Ergebnisse der Microarray-Analyse und der Promotoranalyse wurden mit Hilfe von Northern Hybridisierungen und real-time PCRs ueberprueft und die Repressionsstaerke durch AmtR quantifiziert. Dabei konnte nicht nur fuer die schon genannten Gene, sondern auch fuer das gluABCD-Operon (kodiert fuer einen Glutamattransporter), das NCgl2300-2302-Operon, das NCgl1015-1918-Operon (kodiert fuer einen putativer Peptidtransporter), das urtABCDE-Operon (kodiert fuer den Harnstofftransporter), das ureABCEFGD-Operon (kodiert fuer die Urease), das NCgl1362-Gen, das cda-Gen (kodiert fuer eine Creatinindeaminase) und das NCgl1099-Gen eine AmtR-abhaengige Regulation gezeigt werden. Die putativen AmtR-Bindesequenzen, die durch die Promotoranalyse ermittelt worden sind, wurden mit Hilfe von Gelretardationsassays ueberprueft. Durch Erstellung eines multiplen Alignments konnten eine Konsensussequenz abgeleitet werden: T t t C T A T n g n n c n A T A G a Großbuchstaben: streng konserviertes Motiv; Kleinbuchstaben: konserviertes Motiv Buchstabe n: keine Konservierung

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language AmtR - a global repressor of the nitrogen control in Corynebacterium glutamicum English
Translated abstract:	Abstract Language AmtR - a global repressor of the nitrogen control in Corynebacterium glutamicum The Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum is used in industrial processes to synthesize amino acids - mainly glutamate and lysine - and gained great biotechnological importance in the last few years. For the production of amino acids a good nitrogen supply of the cell is essential. C. glutamicum is able to take up and use a broad spectrum of nitrogen sources such as ammonia, urea, glutamate, and glutamine. The adaptation of bacteria to a particular enviromental condition occurs by the synthesis of specific transporters systems and assimilating enzymes. Both, regulation on the level of expression and activity prevent an unnecessary loss of energy by futile cycling and are termed nitrogen control. Under nitrogen surplus, the regulator AmtR represses the transcription of the amt-soxA-ocd operon, the amtB-glnK-glnD operon, the gltBD operon, as well as the genes glnA, crnT, and NCgl1099. In this work the AmtR-regulon was investigated in detail. First of all the effect of the amtR deletion on the transcriptome of the cell was characterized using DNA-microarrays. Furthermore, the genome of C. glutamicum was screened for putative AmtR binding sites by a bioinformatic approach. The results of microarray analysis and bioinformatic approach were examined by Northern Hybridization experiments and real-time PCR and, simultaneously, the strength of repression by AmtR was quantified. Beside the genes mentioned above, new AmtR-regulated genes like the gluABCD operon (encoding a glutamate transporter), the NCgl2300-2302 operon, the NCgl1015-1918 operon (encoding a putative peptide transporter), the urtABCDE operon (coding for an urea transporter), the ureABCEFGD operon (coding for an urease), the NCgl1362-gene, the cda-gene (encoding a creatinine deaminase) and the NCgl1099-gene were found. The putative AmtR binding sequences, which were determined by the bioinformatic approach, were proven by gel retardation assays. By the application of a multiple alignment a consensus sequence could be derived: T t t C T A T n g n n c n A T A G a a A capital letters: strong conserved regions, small letters: conserved regions letter n: no conservation English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Beckers, Gabriele g.beckers@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12569
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium , Stickstoffkontrolle , Transkriptomanalyse , AmtR , Repressor German Corynebacterium , nitrogen control , AmtR , repressor , transcriptom English
Date of oral exam:	29 June 2004
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1256