Universität zu Köln

Untersuchung der Genexpression von Dictyostelium discoideum nach Infektion mit Legionella mittels DNA-Microarrays

Farbrother, Patrick (2004) Untersuchung der Genexpression von Dictyostelium discoideum nach Infektion mit Legionella mittels DNA-Microarrays. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Frischwasser-Amöben stellen den natürlichen Wirt von L. pneumophila, den Erreger der Legionärskrankheit dar. Die soziale Amöbe D. discoideum, ein Modellorganismus, wurde verwendet, um die differentielle Genexpression des Wirts nach Infektion mit L. pneumophila zu untersuchen. Dazu wurde ein DNA-Microarray hergestellt, das mit 5906 genspezifischen Sonden etwa die Hälfte des D. discoideum-Genoms repräsentiert. Mit Hilfe interner Kontrollen wurden die gemessenen Faktoren der Induktion und Repression der Expression von Genen überprüft und die Nachweisgrenze des Systems bestimmt. Es wurde untersucht, wie sich die Messunsicherheit durch wiederholte Messungen verringern lässt, und welche Faktoren zur Messunsicherheit beitragen. Ein automatisiertes Auswerteverfahren wurde entwickelt, mit dem die Messspanne des Systems durch die Verwendung von zwei Messbereichen vergrößert wurde. Das Verfahren nutzt freie Software, um alle Messwerte eines Microarray-Experiments gemeinsam zu normalisieren und die differentiell exprimierten Gene zu identifizieren. Mit diesem Microarray-System wurde die Genexpression von D. discoideum nach Infektion mit L. pneumophila untersucht. Die Experimente wurden im Vergleich zu drei Kontrollen, uninfizierten Zellen und Koinkubation mit L. hackeliae sowie mit L. pneumophila DdotA durchgeführt. L. hackeliae und L. pneumophila DdotA sind Legionella Stämme, die eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen aufweisen. Für den Zeitpunkt 24 Stunden nach Infektionsbeginn wurden 140 in D. discoideum differentiell exprimierte Gene identifiziert. Bei einigen handelt es sich um Gene, die für bekannte Proteine von D. discoideum kodieren. Dazu gehören RtoA, Discoidin I, CotB und die lysosomale a-Mannosidase. Anderen konnte mittels Homologie-Suche eine Funktion zugeordnet werden. Hierzu zählen das molekulare Chaperon ClpB, b�-COP und drei kleine Calcium-bindende Proteine. Mit Hilfe einer Kategorisierung der Sonden nach zellulären Prozessen wurden die Genexpressionsänderungen auch auf einer funktionellen Ebene analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass besonders viele Gene reguliert sind, deren Produkte am Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Die Genexpression wurde auch in einer Zeitreihe der Infektion über 48 Stunden untersucht. Dabei zeigte sich, dass drei Stunden und 24 Stunden nach Infektionsbeginn die meisten Änderungen auftreten. Die mit dem Microarray identifizierten Änderungen der Genexpression wurden für zehn Gene mittels quantitativer PCR und Northernblots bestätigt.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Freshwater amoebae are the natural host of L. pneumophila, the causative agent of Legionnaires� disease. The social amoeba D. discoideum, a model organism, was used to investigate differential gene expression of the host after infection with L. pneumophila. For that purpose a DNA microarray was produced, that consists of 5906 gene-specific probes representing about half the genome of D. discoideum. Using internal controls, the measured folds of induction and repression of gene expression were checked and the detection limit of the system determined. It was examined, how the measuring inaccuracy can be reduced by repeated measurements and which effects contribute to the inaccuracy. An automated analysis procedure was developed, that increases the measuring range of the system, by utilizing two measuring ranges. The procedure uses free software, to normalize all measured values of a microarray experiment together and identify the differentially expressed genes. This microarray system was used to analyze the gene expression of D. discoideum after infection with L. pneumophila. The experiments were performed in comparison to three controls, uninfected cells and co-incubation with L. hackeliae as well as L. pneumophila DdotA. L. hackeliae and L. pneumophila DdotA are Legionella strains with reduced pathogenicity and a deleted pathogenicity gene respectively. For the 24-hour time point post infection, 140 differentially expressed D. discoideum genes were identified. A few of these genes code for well characterized D. discoideum proteins. Among these are RtoA, Discoidin I, CotB and the lysosomal a-mannosidase. Functions could be assigned to others by homology searches. The molecular chaperone ClpB, b�-COP and three small calcium binding proteins are some of these. With the aid of a categorization of probes by cellular processes, the alterations in gene expression were analyzed on a functional level. It could be shown, that especially many genes are regulated, whose products are involved in nucleotide metabolism or that are ribosomal proteins. The gene expression was also investigated during a 48-hour time course of infection. This revealed, that most of the changes occur three and 24 hours after infection. The differential expression of ten genes identified with DNA microarrays was confirmed by quantitative PCR and northern blots.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Farbrother, Patrickake56@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-12579
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Dictyostelium , Legionella , Microarray , Infektion , GenexpressionGerman
    Dictyostelium , Legionella , microarray , infection , gene expressionEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Biochemie I
    Language: German
    Date: 2004
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 16 June 2004
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 21 Sep 2004 11:42:08
    Referee
    NameAcademic Title
    Noegel, Angelika A.Prof. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1257

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