Universität zu Köln

Molecular analysis of petal development by X-ChIP and two-hybrid technology

Lauri, Andrea (2005) Molecular analysis of petal development by X-ChIP and two-hybrid technology. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Flowers of eudicots like Antirrhinum and Arabidopsis are composed of four concentric whorls, where four different kinds of organs develop: sepal and petals in the two outermost whorls and the sexual organs, stamens and carpels, in the centre of the flower. Organ development is determined by homeotic genes that interact according to the ABCDE model. The homeotic B class genes, represented by DEFICIENS (DEF) and GLOBOSA (GLO) in Antirrhinum and APETALA3 (AP3) and PISTILLATA (PI) in Arabidopsis, participate together with class A and E factors in regulating petals development and together with class C and E in stamens development. In the work here presented, class B target genes are investigated in Antirrhinum and Arabidopsis by Crosslinked Chromatin ImmunoPrecipitation (X-ChIP) experiments, to prove the direct protein-DNA interaction by an immunoprecipitation. In this study a new approach is presented and discussed for the X-ChIP data analysis that includes more controls with respect to the standard procedure reported in literature, and that allows the discrimination of false positive results. This new approach showed that the interaction of DEF protein with the promoter of the putative targets GLOBOSA, DEFICIENS and EXTENSIN is not demonstrable at these conditions and revealed its interaction with the promoter of DEFH125. Protein-protein and protein-DNA interactions that involve Class B factors have been studied in yeast: new interactors of AP3 and PI were isolated by a three-hybrid screening. Class B transcription factors determine the fate of petal primordia, but not their initiation, which is controlled by other genes, like ROXY1, which belongs to the plant glutaredoxin (GRX) family. roxy1 mutant phenotype presents a reduced number of petals and abnormalities during further petal development. GRXs are small proteins involved in posttranslational modifications of target proteins via redox reactions. In order to shed light on its activity, ROXY1 was used as bait in a two-hybrid screening. Among many isolated clones, the transcription factors TCP3, TCP4 and TCP21 were chosen for a further investigation. TCP proteins have been shown to participate in the control of cell proliferation and can be functionally linked to ROXY1 because, at early stages of roxy1 developing flower, misregulation of cell proliferation leads to phenotypic abnormalities. In order to support an in vivo interaction, in situ hybridizations were conducted, revealing that the expression domains of TCP3, TCP4 and TCP21 overlap with that of ROXY1 at early stages of floral development.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Blüten eudikotyler Pflanzen wie Arabidopsis und Antirrhinum bestehen aus vier konzentrischen Wirteln, die verschiedene Organe bilden: Sepalen und Petalen in den beiden äusseren Wirteln, und die sexuellen Organe - Stamen und Karpelle - im Zentrum der Blüte. Die Organentwicklung wird gesteuert durch homöotische Gene, die nach dem ABCDE-Modell miteinander interagieren. Die homöotischen B-Klasse Gene, die in Antirrhinum durch DEFICIENS (DEF) und GLOBOSA (GLO), und in Arabidopsis durch APETALA3 (AP3) und PISTILLATA (PI) repräsentiert werden, wirken zusammen mit Klasse-A und -E Genen in der Petalenentwicklung, und mit den Klasse-E und -C Genen in der Stamenentwicklung. In der vorliegenden Arbeit wurden Zielgene der Klasse-B Faktoren in Antirrhinum und Arabidopsis mit der Crosslinked Chromatin ImmunoPrecipitation (X-ChIP)-Technik untersucht, um eine direkte Protein-DNA-Interaktion durch Immunofällung nachzuweisen. Es wird hier eine neue Herangehensweise an die X-ChIP-Datenanalyse präsentiert und diskutiert, die im Vergleich mit Standardprotokollen aus der Literatur mehr Kontrollen beinhaltet und ein Erkennen falscher Positivresultate erlaubt. Dieser neue Ansatz zeigte, dass die Interaktion des DEF-Proteins mit den Promotoren der vermeintlichen Zielgene GLOBOSA, DEFICIENS und EXTENSIN unter den gegebenen Konditionen nicht demonstriert werden kann, dafür aber eine Interaktion von DEF mit dem Promoter von DEFH125. Interaktionen zwischen Proteinen und Protein und DNA an denen B-Klasse Gene beteiligt sind, sind bisher in Hefe untersucht worden. Hierbei konnten neue Interaktoren von AP3 und PI durch Hefe-2-Hybrid Screens isoliert werden. Transkriptionsfaktoren der Klasse B determinieren das Schicksal von Organprimordien, nicht aber deren Initiierung, welche durch andere Gene, wie z.B. ROXY1 kontrolliert wird. ROXY1 gehört zur Familie der pflanzlichen Glutaredoxinen (GRX). Individuen, die für ROXY1 mutant sind, zeigen eine Reduktion der Petalenanzahl und Abnormalitäten während der weiteren Petalenentwicklung. Glutaredoxine sind kleine Proteine, die die posttranslationale Modifikation ihrer Zielgene über Redoxreaktionen bewirken. Um die Aktivität von ROXY1 näher zu untersuchen, wurde das Protein als �Köder� in einem Hefe-2-Hybrid Screen verwendet. Unter vielen isolierten Klonen wurden die Transkriptionsfaktoren TCP3, TCP4 und TCP21 zu weiteren Studien ausgewählt. TCP-Proteine wirken an der Kontrolle von Zellproliferation mit und können funktionell mit ROXY1 in Zusammenhang gebracht werden, da eine Misregulation der Zellteilung in roxy1-Mutanten in frühen Stadien der Blütenentwicklung zu phänotypischen Abnormalitäten führt. Um die beschriebene in vivo Interaktion zu unterstützen, wurden in situ Hybridisierungen durchgeführt, die zeigten, dass in frühen Stadien der Blütenentwicklung die Expressionsdomänen von TCP3, TCP4 und TCP21 mit der von ROXY1 überlappen.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Lauri, Andrealauri@mpiz-koeln.mpg.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-15598
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Chromatin immunoprecipitation, MADS, glutaredoxinEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > MPI für Züchtungsforschung
    Language: English
    Date: 2005
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 05 June 2005
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 26 Sep 2005 10:50:08
    Referee
    NameAcademic Title
    Saedler, HeinzProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1559

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