Universität zu Köln

T-plastin, a cytoskeletal protein with important function in axonal growth, acts as a modifier of spinal muscular atrophy

Oprea, Gabriela-Elena (2007) T-plastin, a cytoskeletal protein with important function in axonal growth, acts as a modifier of spinal muscular atrophy. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Spinal muscular atrophy (SMA) is a common inherited disorder characterized by neurodegeneration of α-motor neurons. SMA is caused by mutation and/or deletion of the SMN1 gene that encodes the survival of motor neuron protein (SMN). Homozygous SMN1 deletion in unaffected persons is a rare event suggesting that the SMA phenotype is modified by other factors. The microarray expression analysis of the SMA discordant families revealed for the first time, a transcript that encodes for a cytoskeletal protein, namely T-plastin, to be the most up-regulated gene in asymptomatic vs. symptomatic SMN1-deleted sibs. A closer look to a possible involvement of T-plastin in SMA pathophysiology revealed exciting observations. First, T-plastin was found to be expressed at high levels in spinal cord and muscle of fetal and adult tissues by semi-quantitative PCR, an observation that provides a strong evidence for T-plastin implication in neuronal differentiation and neuromuscular maturation. Moreover, T-plastin associates with SMN as shown by Co-IP experiments, but this interaction, as demonstrated by in vitro binding assay, is mediated by another so far unknown protein. Second, T-plastin and SMN were found by immunofluorescence to co-localize along the axons, at branch points and at the growth cones in neurite-like extensions in differentiated PC12 cells. Interestingly, the T-plastin protein amount was found to be up-regulated in differentiated PC12 cells under NGF stimulation, an observation that might propose a possible function for T-plastin as substrate for signalling molecules. Moreover, under NGF stimulation, the affinity of T-plastin for SMN increased up to 50% suggesting that a transient complex might occur during neuronal differentiation that contributes to a specific role during this biological process. Third, the effect of T-plastin loss/overexpression in differentiated PC12 cells (cells presenting either shorter neurites when T-plastin was depleted or longer neurites when T-plastin was overexpressed) hints to a perturbation in the axon growth, guidance (and perhaps branching) due to the involvement of T-plastin in F-actin filament formation and stabilization. Interestingly, by in vitro experiments it has been observed that in differentiated PC12 cells expressing low amount of SMN protein, but overexpressing T-plastin, the length of the neurites was rescued at least in part by higher T-plastin levels. This suggests that a higher amount of T-plastin protein might help the growth cone structures to reach their target (the muscle in case of motor neurons). While all analyzed unaffected SMN1-deleted sibs expressed T-plastin in both peripheral blood and EBV-transformed lymphoblastoid cell lines, only 6.5% of the control population expressed T-plastin. In classical SMA patients, T-plastin was highly expressed in 5.9%, medium in 7.4% and very weak in 13.4%. Finally, 8% patients without SMN1 mutations expressed T-plastin. These data suggest that T-plastin expression in leukocytes happens as a rare event in humans and its expression in blood significantly correlates with an SMA protection. Nevertheless, not all blood-T-plastin-expressing SMN1-deleted individuals are SMA protected, which suggest a potential differential regulation in the spinal cord.The answer to the question by which mechanism T-plastin is expressed in unaffected sibs with homozygous absence of SMN1 gene or in control population and classical SMA patients, was not found. No correlation between the T-plastin expression and any mutation or DNA variation in the T-plastin coding region, promoter, 3�UTR or intron 1 was observed. Moreover, epigenetic analysis of the T-plastin regulatory region (promoter-first exon-first intron) revealed no differences in DNA modification level. These observations together with the haplotype analysis of two blocks described within the T-plastin genomic region in both SMA discordant families and control population, strongly suggest that likely a trans- rather than a cis-acting factor is responsible for the differential expression between SMA discordant sibs or between SMA discordant families and control population. In hope to find additional modifying genes or factors that are able to regulate T-plastin expression, a genome-wide scan analysis was performed in 42 SMA discordant families. Regions on chromosomes 3q, 7p, 16p and 22q, respectively, are suggestive for linkage and require further investigations, however, none of these reached a significant LOD score. Taken together, the discovery of the T-plastin protein as a modulator of the SMA phenotype provides the opportunity to identify novel regulatory mechanisms that may act specifically in motor neurons from asymptomatic sibs with SMN1 homozygous deletion.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Die Spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine der häufigsten rezessiv erblichen Erkrankungen beim Menschen, die sich durch Degeneration der α-Motoneuronen im Rückenmark kennzeichnet. SMA wird durch homozygote Mutationen und/oder Deletionen des SMN1-Gens verursacht, welches für das survival of motor neuron (SMN) Protein codiert. Das Auftreten von homozygoten SMN1-Deletionen bei nicht betroffenen Personen ist sehr selten und weist auf eine Modifikation des SMA-Phänotyps durch andere Faktoren hin. In der differentieller Expressionuntersuchung nach Microarray-Analyse zeigte T Plastin, ein Zytoskelettprotein, die stärkste Heraufregulation (39-fach) in allen asymptomatischen SMN1-deletierten Geschwistern im Vergleich zu ihren betroffenen Geschwistern. Eine genauere Untersuchung einer möglichen Rolle von T-Plastin in der Pathophysiologie von SMA führte zu folgenden Ergebnissen: Erstens, wurde eine starke Expression mittels semi-quantitativer multiplex RT-PCR von T-Plastin im fetalen und adulten Rückenmark und in Muskeln nachgewiesen, was einen starken Hinweis für eine Beteiligung bei der neuronalen Differenzierung und der neuromuskulären Reifung darstellt. Mitttels in vitro Co-Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass T-Plastin mit SMN assoziieren kann, wobei es sich nicht um eine direkte Interaktion handelt, wie es in vitro pull-down Experimente bewiesen. Zweitens, Studien mittels Konfokaler Immunfluoreszenz-Lasermikroskopie zeigten eine Co-Lokalisation von T-Plastin und SMN entlang der Axone, an Verzweigungen und an Wachstumskegeln in neuriten-ähnlichen Ausläufern in differenzierten PC12-Zellen. Interessanterweise wurde eine erhöhte Menge an T-Plastin Protein während der neuronalen Differenzierung von PC12-Zellen unter Stimulation mit neuronalem Wachstumsfaktoren (NGF) gemessen, was nahe legt, dass T-Plastin ein mögliches Substrat für unterschiedliche Signalmoleküle darstellen könnte. Ferner nahm die Affinität von T-Plastin für SMN unter NGF-Stimulation um 50% zu. Dies läßt vermuten, dass während der neuronalen Differenzierung ein transienter Komplex auftritt, der zu einer spezifischen Rolle in diesem biologischen Prozeß beiträgt. Drittens, deuten die Auswirkungen des Verlustes bzw. der Überexpression von T-Plastin in differenzierten PC12-Zellen (die Zellen zeigten kürzere Neuriten bei T-Plastin Depletion bzw. längere Neuriten bei T-Plastin Überexpression) auf eine Störung des Wachstums, der Wegfindung und evtl. der Verzweigung von Axonen hin, was durch einen Einfluss von T-Plastin auf die Bildung und Stabilisierung von F-Aktin-Filamenten erklärt werden könnte. Interessanterweise konnte in in vitro Experimenten beobachtet werden, dass in differenzierten PC12-Zellen mit niedriger SMN-Expression aber einer Überexpression von T-Plastin die Länge der Neuriten zumindest zum Teil durch höhere T Plastin-Konzentrationen wiederhergestellt werden konnte. Während alle asymptomatischen SMN1-deletierten Geschwister T-Plastin sowohl im nativen Blut als auch in Epstein-Barr-Virus (EBV) transformierten lymphoblastoiden Zellininien exprimierten, zeigten nur 6,5% der Kontrollen eine Expression im Blut. In klassischen SMA-Patienten fand sich eine starke Expression des T-Plastins in 5,9%, eine mittlere in 7,4% und eine sehr schwache in 13,4%. Dies deutet darauf hin, dass die Expression von T-Plastin im Blut hochsignifikant mit einer SMA-Protektion korreliert. Da allerdings nicht alle SMN1-deletieten Personen einen SMA-Schutz entwickeln, könnte dies auf eine im Rückenmark unterschiedliche Regulation hinweisen. Es wurde weder eine Mutation oder DNA-Variation im codierenden Bereich, noch in der 3� nicht-translatierten Region, im Promotor oder Intron 1 des Genes identifiziert. Außerdem, haben auch epigenetische Studien der CpG-reichen Promotorregion keine Unterschiede aufgedeckt. Letztlich wurde eine umfangreiche Analyse der tagging SNPs (single nucleotide polymorphisms) der Haplotypblöcke, die das T-Plastin auf genomischer Ebene abdecken in phänotypisch-diskordanten SMA-Familien und Kontrollen durchgeführt und keine Assoziation mit der Expression des T-Plastin Gens gefunden. Insgesamt weisen diese Ergebnisse auf eine trans-aktivierende Regulation der Expression von T-Plastin im Blut hin. Um diesen Faktor zu identifizieren, wurde eine genomweite Kopplungsanalyse in 42 phänotypisch diskordanten SMA-Familien durchgeführt. Mehrere Regionen auf den Chromosomen 3q, 7p, 16p und 22q zeigten eine mögliche Kopplung und müssen durch weitere Untersuchungen bestätigt werden. Zusammenfassend stellt die Entdeckung des T-Plastin Proteins als Modulator des SMA-Phänotyps neue Wege dar, regulatorische Mechanismen zu identifizieren, die spezifisch in Motoneuronen von asymptomatischen Geschwistern mit SMN1-Deletion auftreten und von der Erkrankung schützen.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Oprea, Gabriela-Elenagabriela-elena.oprea@uk-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-20479
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    SMA, SMN, T-plastin, gene modifierEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: English
    Date: 2007
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 04 June 2007
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 03 Jul 2007 09:56:35
    Referee
    NameAcademic Title
    Tautz, DiethardProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2047

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