Universität zu Köln

Two genes involved in trichome morphogenesis: Localisation and putative function of STI and At-CLASP in A. thaliana.

Herrmann, Ullrich (2007) Two genes involved in trichome morphogenesis: Localisation and putative function of STI and At-CLASP in A. thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Within the scope of this thesis two proteins were analysed whose mutant phenotype affects the branching of trichomes. at-clasp mutant plants posses unbranched trichomes and the strength of the phenotype depends on the allele used. Sterility is observed in the strongest alleles. Furthermore it was shown that the at-clasp mutant phenotype is temperature dependant. Growth conditions with temperatures up to 16°C are permissive for normal growth of all alleles. To determine the localisation of At-CLASP, fusions to fluorescent proteins were constructed. It was shown that At-CLASP is localised to microtubules. Contrary to the data from H. sapiens, At-CLASP localisation was not restricted to the +end of microtubules but marks filaments almost entirely. To understand the binding properties of At-CLASP to microtubules, it was dissected into two fragments. The C-terminal region of the protein was localised to the cell-cortex or the plasma membrane. In contrast, the N-terminal region was sufficient to mediate the binding to microtubules as this fragment was hardly distinguishable from the entire protein. Despite the altered localisation of At-CLASP compared to H. sapiens CLASP, several orthologs of H. sapiens CLASP interaction partners were identified in the A. thaliana genome. These putative A. thaliana binding partners were tested for interaction with At-CLASP in direct Yeast-Two-Hybrid experiments. However, no interactions were detected. One postulated function of CLASP from H. sapiens is the stabilisation of subsets of microtubules. To test a similar function of the A. thaliana protein, the rescue of the tfc-a mutant under an increased dosage of At-CLASP was analysed. Preliminary results suggest that a stabilizing function of At-CLASP might be evolutionary retained. Trichomes of strong stichel alleles are completely unbranched. To improve the understanding of STI function plants expressing GFP:STI fusions were analysed further. GFP:STI fusion proteins mark the tip of emerging trichomes. As soon as a trichomes becomes visible by means of morphological criteria, GFP:STI can be detected in the tip of trichomes. Trichomes that initiate the second branch showed GFP:STI signal even before the branch was visible. Plasmolysis experiments demonstrated that GFP:STI is likely localised to the plasma membrane. In order to get a closer insight into which part of the STI protein is responsible for its specific localization, fragments were analysed for showing a comparable localisation pattern. Fusions of parts of the STI protein with YFP could not reveal the likely present motif for the described localisation. Nevertheless one longer fragment S1/AS3 and one shorter fragment S3/AS3 showed a strong dominant negative effect when overexpressed in wild-type. To increase the understanding about the molecular function of STI, possible binding partners of GFP:STI were identified by an immunoprecipitation assay. Phospholipase Dα1 and one transcription factor of the MADS-box family were identified as candidates for interaction with STI. A. thaliana contains one gene (STI-HOM) which is very similar to STI. To test whether STI-HOM fulfils a comparable a role in trichome development T-DNA mutants were analysed. None of them showed a trichome phenotype. The analysis of a sti sti-hom double-mutant situation revealed no change in the sti mutant trichome phenotype. Promoter swapping experiments were performed to test whether both proteins are functionally exchangeable. However STI-HOM was not able to rescue the sti mutant trichome phenotype. Therefore STI and STI-HOM are likely functionally distinct.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Proteine untersucht, dessen mutanter Phänotyp eine gestörte Verzweigung von Trichomen ist. at-clasp mutante Pflanzen sind unterverzweigt und die Stärke des Phänotyps ist vom verwendeten Allel abhängig. Sterilität der Pflanzen wurde bei starken Allelen beobachtet. Weiterhin wurde gezeigt, dass der at-clasp mutante Phänotyp abhängig von der Temperatur ist. Wachstumsbedingungen mit Temperaturen von maximal 16°C erlauben normales Wachstum. Um die Lokalisierung von At-CLASP festzustellen wurden Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen hergestellt. Es wurde gezeigt, dass At-CLASP an Mikrotubuli lokalisiert ist. Im Gegensatz zu den Daten von H. Sapiens ist At-CLASP nicht ausschließlich am +Ende von Mikrotubuli lokalisiert, sondern markiert vollständige Filamente. Um die Bindung von At-CLASP an Mikrotubuli besser zu verstehen wurde es in zwei Fragmente unterteilt. Der C-terminale Bereich des Proteins war am Zell-Cortex oder der Plasmamembran lokalisiert. Im Gegensatz dazu war der N-terminale Bereich ausreichend, um Mikrotubuli zu binden und konnte somit vom Lokalisierungsmuster des vollständigen Proteins kaum unterschieden werden. Abgesehen vom veränderten Lokalisierungsmuster von At-CLASP im Vergleich zu H. sapiens CLASP wurden verschiedene Orthologe von H. sapiens CLASP Bindungspartnern im Genom von A. thaliana identifiziert. Diese putativen Bindungspartner aus A. thaliana wurden auf Interaktion mittels des direktem Hefe-2-Hybrid Systems getestet. Jedoch konnte keine Interaktion festgestellt werden. Eine putative Funktion von CLASP aus H. sapiens ist die Stabilisierung von bestimmten Mikrotubuli Filamenten. Um eine ähnliche Funktion des A. thaliana Proteins zu überprüfen wurde versucht die tfc-a Mutante mit einer erhöhten Menge von At-CLASP zu retten. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine solche Funktion evolutionär erhalten geblieben sein könnte. Trichome von starken stichel Allelen sind vollständig unverzweigt. Um das Verständnis über die Funktion von STI zu verbessern wurden GFP:STI Fusionen untersucht. GFP:STI Fusionsproteine markieren die Spitze von Trichomen. Sobald ein Trichome aufgrund von morphologischen Kriterien zu erkennen ist, kann GFP:STI in der Spitze detektiert werden. Trichome, die sich kurz vor der Einführung der zweiten Verzweigung befinden zeigen das GFP:STI Signal am Ort der Spitze der neuen Verzweigung bevor diese zu erkennen ist. Plasmolyse Experimente zeigten, dass GFP:STI wahrscheinlich in der Plasmamembran lokalisiert ist. Um festzustellen welcher Teil des STI Proteins notwendig ist, um diese spezifische Lokalisierung zu erreichen wurden Fragmente auf ein vergleichbares Lokalisierungsmuster untersucht. Jedoch konnten Fusionen von YFP mit verschiedenen Fragmenten keine möglicherweise vorhandenen Motive, welches erforderlich für die Lokalisierung sein könnte, identifizieren. Interessanterweise zeigten ein längeres Fragment S1/AS3 und ein kürzeres Fragment S3/AS3 einen starken dominant negativen Effekt wenn sie im Wildtyp überexprimiert wurden. Um das Verständnis der molekularen Funktion von STI zu verbessern wurden mögliche Bindungspartner von GFP:STI über Immunopräzipitation identifiziert. Phospholipase Dα1 und ein Transkriptionsfaktor der MADS-box Familie wurden als Kandidaten für eine mögliche Interaktion mit STI identifiziert. A. thaliana enthält ein Gen (STI-HOM) welches sehr ähnlich zu STI ist. Um festzustellen ob STI-HOM eine vergleichbare Rolle in der Trichomentwicklung hat wurden T-DNA Mutanten untersucht. Keine davon zeigte einen Trichomphänotyp. Auch die Analyse von sti sti-hom Doppelmutanten zeigte keine Änderung des sti mutanten Trichomphänotyps. Außerdem wurden Experimente durchgeführt bei denen der Promoter von beiden Genen getauscht wurde, um festzustellen ob beide Proteine funktional austauschbar sind. Jedoch war STI-HOM nicht in der Lage den sti mutanten Trichomphänotyp zu retten. Somit ist es wahrscheinlich, dass STI und STI-HOM funktonal unterschiedlich sind.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Herrmann, Ullrichullrich.herrmann@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-22268
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Arabidopsis thaliana , Trichome , STICHEL , CLASPGerman
    Arabidopsis thaliana , Trichome , STICHEL , CLASPEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Botanisches Institut
    Language: English
    Date: 2007
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 04 November 2007
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 29 Jan 2008 09:13:00
    Referee
    NameAcademic Title
    Hülskamp, MartinProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2226

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