Universität zu Köln

Fraktionierung der stabilen Kohlenstoffisotope in der Steroid-Biosynthese durch 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A Reduktase

Lüdke, Svena (2008) Fraktionierung der stabilen Kohlenstoffisotope in der Steroid-Biosynthese durch 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A Reduktase. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Stabile Kohlenstoffisotope zeigen in natürlichen Materialien eine nicht-statistische Verteilung. Vergleicht man die Isotopenverhältnisse unterschiedlicher chemischer Verbindungen, können Aussagen über Stoffquellen und Biosynthesewege getroffen werden. Die Isotopenverhältnisse hängen von biosynthetischen Prozessen ab, die eine 13C/12CFraktionierung verursachen können. Im Falle der Lipide beobachtet man typischerweise eine deutliche 13C-Abreicherung gegenüber dem 13C/12C-Verhältnis der gesamten Biomasse eines Organismus. Allerdings zeigen die humane Steroidhormone, die eine Untergruppe der Lipide darstellen, nur eine geringe 13C-Abreicherung gegenüber der Biomasse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zum Verständnis dieses speziellen Phänomens beizutragen. Im Metabolismus kann ein kinetischer Isotopeneffekt nur eine Isotopenfraktionierung verursachen, wenn eine unvollständige Umsetzung des Substrats stattfindet oder sich der Biosyntheseweg verzweigt. Daher wurde hier eine Enzymreaktion betrachtet, die als der limitierende Schritt des Mevalonatbiosynthesewegs, aus dem unter anderem die Steroide hervorgehen, gilt. Die katalytische Domäne der humanen 3-Hydroxy-3-methylglutaryl Coenzym A Reduktase (HMGR) wurde bakteriell exprimiert und gereinigt. Während der enzymatischen Umsetzung des eingesetzten Substrats wurden in bestimmten Zeitabständen Proben aus der Reaktionslösung entnommen. Aus den Proben wurde das Reaktionsprodukt isoliert und mittels Gaschromatographie-gekoppelter Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie analysiert. Für die Abhängigkeit zwischen dem Isotopenverhältnis und dem Zeitpunkt der Probennahme wurde in dieser Arbeit ein mathematisches Modell entwickelt und eine Kurvenanpassung an die Messwerte durchgeführt. Für die in vitro HMGR-Reaktion ergab sich ein durchschnittlicher Fraktionierungsfaktor 12k/13k von 1,0031 mit einer Standardabweichung von 0,0004 für alle Kohlenstoffatome im analysierten Produktmolekül. Der mögliche Einfluss der HMGR-Reaktion auf das Isotopenverhältnis der Steroide wird diskutiert.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Stable carbon isotope ratios exhibit non-statistical distributions in natural compounds. The interpretation of differences in isotope patterns permits the elucidation of biosyntheses and origin assignments of natural compounds. Isotope ratios depend on biosynthetic processes that may cause 13C/12C fractionation. Lipids are typically strongly depleted in 13C versus other classes of biological compounds of the same organism. However, steroid hormones form a subgroup of lipids. But in contrast to other lipids, human steroid hormones are only slightly 13C-depleted compared to biomass. The present work may contribute to the understanding of this phenomenon. Kinetic isotope effects in metabolism can only become effective in connection with incomplete turnover of the substrate or branching of the biosynthetic pathway. Hence, the limiting enzyme reaction of the mevalonic pathway, which leads to the formation of steroids, was investigated here. The catalytic domain of human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) was bacterially expressed and purified. During the course of the enzyme reaction, samples were removed from the reaction mixture. The reaction product was isolated from the samples and analysed by gas chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry. A model describing the dependence of the isotopic ratio and the time of sample taking was developed in this work and fitted to the data. An average fractionation factor 12k/13k of 1.0031 with a standard deviation of 0.0004 was estimated for all carbon atoms contained in the product molecule. The possible effect of the reaction of HMGR on the isotopic ratio of steroids was discussed.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Lüdke, Svenas.luedke@biochem.dshs-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-26038
    Subjects: Chemistry and allied sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Mevalonat , HMGR , Lipide , Steroide , Kinetischer Isotopeneffekt , DopinganalytikGerman
    mevalonate , HMGR , lipids , steroids , kinetic isotope effect , doping controlEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Biochemie
    Language: German
    Date: 2008
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 23 October 2008
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 04 Feb 2009 15:14:59
    Referee
    NameAcademic Title
    Schomburg, DietmarProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2603

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