Universität zu Köln

Molekulare Mechanismen der Staphylococcus aureus induzierten Autophagie

Sabel, Katja (2009) Molekulare Mechanismen der Staphylococcus aureus induzierten Autophagie. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Staphylococcus aureus ist dazu in der Lage nicht-professionelle Phagozyten zu infizieren. Wildtyp agr S. aureus Stämme nutzen das Autophagosom als protektive Nische, um intrazellulär zu replizieren und verursachen schließlich den Tod der Wirtszelle. S. aureus Stämme, die über kein intaktes agr-Genregulationssystem verfügen, werden über den phagolysosomalen Weg eliminiert. In der Hefe ist Atg1 ein essentieller Regulator der Autophagie. Daher wurden im ersten Teil dieser Arbeit die Rollen der Atg1-Säugetierhomologe, Ulk1, Ulk2 und Ulk3 in der S. aureus-vermittelten Autophagie analysiert. Überraschenderweise konnten in Zellen, in denen die Ulk1 Expression konstitutiv inhibiert war, bereits in nicht infizierten Zellen signifikant erhöhte Mengen des autophagosomalen Markerproteins LC3-II detektiert werden. Während die Induktion der Autophagie durch S. aureus oder Rapamycin nicht beeinträchtigt war, wiesen Ulk1-defiziente Zellen Defekte in der autophagosomalen Maturation bzw. dem lysosomalen Abbau auf. Ulk2- und. Ulk3-defiziente Zellen zeigten dagegen keine Veränderungen der Autophagie. Agr-defiziente S. aureus Stämme zeigten in Ulk1-defizienten Zellen eine deutlich erhöhte Replikation und Wirtszelltoxizität. Zusätzlich war die Kolokalisation agr-defizienter Bakterien mit dem autophagosomalen Marker LC3 erhöht und mit lysosomalem Marker verringert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Abwesenheit von Ulk1 zu einer zellulären Akkumulation defekter, autophagosomaler Kompartimente führt, die von agr-defizienten S. aureus als replikative Nische genutzt werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde überprüft, ob die intrazelluläre Expression von single chain variable fragment (scFv) Wirtszellen vor dem Zelltod durch S. aureus Infektion schützen kann. Dazu wurden die scFvs der Tomlinson Phage Display Bibliothek so umkloniert, dass sie stabil und löslich in Hela Zellen exprimiert werden konnten. Durch mehrfache Infektion dieser intrazellulären Bibliothek mit dem zytotoxischen S. aureus Stamm MW2 wurden aus dem Pool von Intrabody exprimierenden Zellen zwei Klone selektioniert, die eine erhöhte Vitalität nach der Infektion zeigten. Durch Reklonierung der scFv-kodierenden Gene konnte der S. aureus resistente Phänotyp reproduziert werden. Analysen der Autophagie in den selektionierten Klonen ergaben, dass die intrazelluläre Expression des einen scFvs zu einer verringerten S. aureus-induzierten Autophagosomenbildung führte.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Staplylococcus aureus is able to infect non-professional phagocytes. Wildtype agr S. aureus strains use the autophagosome as a protective nische for intracellular replication and eventually induce host cell death. However, S. aureus strains that are deficient for the agr gene regulator will be eliminated by the phago-lysosomal pathway. Atg1 is an essential autophagy regulator in yeast. In the first part of this thesis the roles of the mammalian Atg1 homologues, Ulk1, Ulk2 and Ulk3 were analysed in S. aureus-mediated autophagy. Surprisingly, in non-infected cells where Ulk1 protein expression was constitutively inhibited, the amount of the autophagosomal marker protein LC3-II was significantly increased. Induction of autophagy in Ulk1-deficient cells by S. aureus infection or rapamycin treatment was unaffected, while autophagosomal maturation or lysosomal degradation was defective. However, cells deficient in Ulk2 or Ulk3 showed no alterations in autophagy. In Ulk1-deficient cells, replication and host cell toxicity of agr-deficient S.aureus strains was clearly increased. Additionally, agr-deficient S. aureus showed increased co-localisation with the autophagosomal marker LC3 and reduced co-localisation with a lysosomal marker. These results suggest, that the absence of Ulk1 results in a cellular accumulation of defective autophagosomal compartments, which provide a replicative nische for agr-deficient S. aureus strains. In the second part of this project the question of whether the intracellular expression of single chain variable fragments (scFvs) can protect cells from S. aureus induced cell death was addressed. To this end, the scFvs of the Tomlinson Phage Display library were subcloned, so that soluble protein fragments were stably expressed in HeLa cells. After multiple infections of this intracellular library with the cytotoxic S. aureus strain MW2, two clones that exhibited increased vitality were selected out of the pool of intrabody expressing cells. The S. aureus resistant effect could be reproduced by subcloning of the scFv-coding genes. Analysis of the autophagic properties of these selected clones suggested that the intracellular expression of one of the scFvs causes reduced S. aureus-induced autophagosome formation.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Sabel, Katjakatjasabel@gmx.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-28518
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    S.aureus , Autophagie , Ulk1 , Atg1German
    S.aureus , autophagy , Ulk1 , Atg1English
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 2009
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 28 June 2009
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 13 Oct 2009 10:02:19
    Referee
    NameAcademic Title
    Howard, JonathanProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2851

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