Universität zu Köln

The Impact of Peptide Insertions on Adeno-Associated Viral Vector Fate

Uhrig, Silke (2010) The Impact of Peptide Insertions on Adeno-Associated Viral Vector Fate. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors possess a number of attractive properties including low immunogenicity, high stability, longevity of transgene expression and the potential to integrate site-specifically without known side-effects. The major limitation regarding the use of AAV vectors for gene therapy is the broad tissue tropism of AAV following in vivo gene tranfer application. Recently, genetic modification of the AAV capsid by insertion of receptor-specific ligands (AAV targeting) was demonstrated to enable the transduction of cells in the absence of AAV�s natural receptors, to improve transduction efficiency in wild-type-AAV-permissive cells and to provide the opportunity of rAAV-mediated, cell-type-specific gene transfer. This study shows for the first time, that the inserted ligand both alters the mechanism of AAV vector internalization and determines the efficiency of cell entry and nuclear delivery of vector genomes. Using AAV peptide display, four rAAV peptide insertion mutants differing in sequence and net charge of the inserted ligand were selected and analyzed regarding their vector-cell interplay in comparison to rAAV2. Mutants (A2 and C2) displaying neutral peptide ligands transduced cells independent of AAV2�s primary receptor heparan sulphate proteoglycan (HSPG), whereas the affinity of the mutants B1 and D5 to HSPG correlated with the net positive charge of their ligands. Compared to rAAV2, the affinity to HSPG was lower for B1, but notably higher for D5. Ligand-receptor interaction led to clathrin-dependent uptake of A2 and C2, while D5 entered cells clathrin-independently, presumably via HSPG. Interestingly, B1, differing in a single amino acid from C2, was able to use both entry routes. Mediated by their ability to bind to HSPG, B1 and D5 � in contrast to A2 and C2 � entered efficiently into different cell lines. However, efficient transgene expression was dependent on vector entry by clathrin-mediated endocytosis. While the onset of gene expression happened in a similar time frame for all AAV vectors, those vectors internalized in a clathrin-mediated fashion (rAAV2, A2 and C2) reached significantly higher gene expression levels, demonstrating that this entry route is pivotal for efficient intracellular processing. In line with this observation, B1 and D5 � which entered the cell clathrin-independently � delivered significantly less vector genomes to the nucleus than rAAV2, but were mostly present inside membrane-coated cellular compartments � most likely inside endosomes � revealing that vector trafficking following proteoglycan-dependent endocytosis is impaired compared to the efficient intracellular processing of rAAV2.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Rekombinante Adeno-assoziierte virale (rAAV) Vektoren besitzen eine Reihe für einen Vektor vorteilhafter Eigenschaften, darunter sind eine geringe Immunogenität, hohe Stabilität, langlebige Transgenexpression und das Potential zur ortsspezifischen Integration ohne bisher bekannte Nebenwirkungen zu nennen. Der Einsatz von rAAV-Vektoren in der Gentherapie wird jedoch dadurch limitiert, dass AAV einen breiten Gewebetropismus aufweist, der zu einer unerwünschten Transduktion von Nicht-Zielzellen führen kann. Kürzlich wurde demonstriert, dass die genetische Modifizierung des AAV-Kapsids durch Insertion rezeptorspezifischer Liganden (�AAV targeting�) die Transduktion von Zellen unabhängig vom Vorhandensein der natürlichen AAV-Rezeptoren ermöglicht. Die �AAV-targeting�-Technologie führt darüber hinaus zu einer Erhöhung der Transduktionseffizienz auf Wildtyp-AAV-permissiven Zellen und bietet die Möglichkeit zu einem AAV-vermittelten, zelltypspezifischen Gentransfer. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass der inserierte Ligand sowohl den Mechanismus der Internalisierung des AAV-Vektors bestimmt, als auch die Effizienz, mit der Vektoren in die Zelle und Vektorgenome in den Zellkern übertragen werden. Mit Hilfe von �AAV peptide display� wurden vier rAAV-Peptidinsertionsmutanten selektiert, die sich in der inserierten Sequenz und der Nettoladung der Insertion unterscheiden, und im Hinblick auf ihre Vektor-Zell Interaktion im Vergleich zu rAAV2 analysiert. Mutanten (A2 und C2) mit neutralen Peptidliganden transduzierten Zellen unabhängig vom AAV2-Primärrezeptor Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG), während die Affinität der Mutanten B1 und D5 zu HSPG mit der positiven Nettoladung Ihrer Liganden korrelierte. Im Vergleich zu rAAV2 wies B1 eine niedrigere Affinität zu HSPG auf, D5 hingegen eine wesentlich höhere. Die neue Liganden-Rezeptor Interaktion führte zu einer Clathrin-vermittelten Aufnahme von A2 und C2, während D5 auf einem Clathrin-unabhängigen Weg in die Zelle eintrat � vermutlich über HSPG. Obwohl sich B1 nur in einer Aminosäure von C2 unterscheidet, war B1 in der Lage, sowohl Clathrin-vermittelt, als auch Clathrin-unabhängig in die Zelle aufgenommen zu werden. Vermittelt durch ihre Fähigkeit, an HSPG zu binden, traten B1 und D5 � im Gegensatz zu A2 und C2 � effizient in verschiedene Zelltypen ein. Effiziente Transgenexpression war hingegen von der Aufnahme der AAV-Vektoren über Clathrin-vermittelte Endozytose abhängig. Während die Transgenexpression bei allen AAV-Vektoren zu einem ähnlichen Zeitpunkt begann, erreichten Clathrin-vermittelt internalisierte Vektoren (rAAV2, A2 und C2) ein sigifikant höheres Genexpressionsniveau, was vermuten lässt, dass dieser Eintrittsmechanismus für eine effiziente intrazelluläre Prozessierung ausschlaggebend ist. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wurden von B1 und D5, die Clathrin-unabhängig in die Zelle gelangten, signifikant weniger Vektorgenome in den Kern übertragen, als von rAAV2. Statt dessen waren die Vektorgenome von B1 und D5 hauptsächlich mit membranumhüllten Zellorganellen � vermutlich Endosomen � assoziiert, was vermuten lässt, dass die intrazelluläre Prozessierung von Vektoren nach Proteoglykan-abhängiger Internalisierung im Vergleich zur effizienten Prozessierung von rAAV2 beeinträchtigt ist.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Uhrig, Silkesilke.uhrig@uni-koeln.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-31886
    Subjects: Life sciences
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Keine Angabe
    Language: English
    Date: 2010
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 31 May 2010
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 06 Oct 2010 15:43:22
    Referee
    NameAcademic Title
    Knebel-Mörsdorf, DagmarProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3188

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