Universität zu Köln

Generierung und Charakterisierung von konditionalen Bdp1-knockout-Mausmodellen - Analysen des Transkriptionsfaktor IIIB-Komplexes

Jakubik, Miriam (2011) Generierung und Charakterisierung von konditionalen Bdp1-knockout-Mausmodellen - Analysen des Transkriptionsfaktor IIIB-Komplexes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    B double prime 1 (BDP1, TFNR) ist eine Untereinheit des Transkriptionsfaktor IIIB-Komplexes und wird für die Transkription aller RNA Pol III-abhängigen Gene benötigt. BDP1 wird ubiquitär, jedoch verstärkt im Cerebellum exprimiert. Das Gen liegt auf dem chromosomalen Abschnitt 5q13 und distal zum survival motor neuron gene 1 (SMN1) - dem krankheitsverursachenden Gen der spinalen Muskelatrophie (SMA). Die SMA ist eine autosomal rezessive, neurodegenerative Erkrankung, die durch eine Muskelschwäche mit nachfolgender Muskelatrophie gekennzeichnet ist. In seltenen Fällen entwickeln SMA-Patienten ein atypisches Symptom in Form einer Gehirnatrophie. Dieser Phänotyp korreliert mit großen Deletionen innerhalb der SMA-Region. Markeranalysen deuteten auf weitere deletierte, distal zum SMN1 gelegene Gene hin, zu denen auch ein Marker in der Nähe des BDP1-Gens zählte. Aus diesem Grund wurde eine Haploinsuffizienz des BDP1-Gens mit der Ausbildung einer Gehirnatrophie hypothetisch in Verbindung gebracht. Zur Klärung dieser Fragestellung wurde ein konditionales Bdp1-Mausmodell mit Hilfe des Cre/loxP-Systems generiert. Tiere mit einer ubiquitären, heterozygoten Bdp1-Deletion (Bdp1ko/wt) zeigten keine besonderen Auffälligkeiten. Um das Ausmaß einer Deletion in heterozygot deletierten Bdp1-Mäusen näher zu untersuchen, wurden die Transkript- und Proteinmengen aller Faktoren des TFIIIB-Komplexes (Bdp1, Tbp, Brf1) und die ausgesuchter Interaktionspartner (TFIIIC102, Erk, Myc, p53, Rb) mittels Realtime- und Western Blot-Analysen im Cerebrum und Cerebellum von Bdp1wt/wt und Bdp1ko/wt-Tieren bestimmt. Dabei wurde in Bdp1ko/wt-Tieren eine Herunterregulation der Bdp1-Expression auf 50 % detektiert. Ebenso wurde von der TFIIIB-Untereinheit Tbp auf RNA und Proteinebene im Cerebellum heterozygot deletierter Bdp1-Tiere eine starke Herabregulation beobachtet, wodurch dem Bdp1-Protein eine gewebespezifische Funktion zugewiesen werden könnte. Weiterhin wurde bei fast allen Interaktionspartnern eine Herunterregulation der Transkript- bzw. der Proteinmengen detektiert. Somit hatte eine heterozygote Bdp1-Deletion Einfluss auf interagierende, den TFIIIB-Komplex regulierende Proteine. Mittels Northern Blot-Analysen wurden zusätzlich erhöhte Transkriptmengen der U6 snRNA im Cerebellum von Bdp1ko/wt-Tieren nachgewiesen. Die Ergebnisse der Realtime-Analysen wurden in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF, Bdp1ko/wt) nicht bestätigt. Hier wurden weitestgehend erhöhte Transkriptmengen der Untereinheiten des TFIIIB-Komplexes und die der Interaktionspartner detektiert. Die abweichenden Genexpressionen haben wahrscheinlich entwicklungs- oder gewebespezifische Ursachen. Der homozygote Verlust des Bdp1-Gens führte zur embryonalen Letalität im Präimplantationsstadium (um E2.5 p.c.). In vitro-kultivierte Bdp1ko/ko-Embryonen (E3.5 p.c.) zeigten eine fragmentierte innere Zellmasse mit massiver Volumenabnahme. Somit scheint das Bdp1-Protein eine wichtige Funktion während der frühen Embryogenese einzunehmen. Über die Behandlung von Bdp1fl/fl-MEF mit rekombinanter HTN-Cre wurde eine in vitro-Deletion des Bdp1-Gens induziert, welche zum Zelltod führte. Mittels MTT-Analysen wurde eine verringerte Zellvitalität in homozygot deletierten Bdp1-MEF nachgewiesen - diese Daten bestätigten die Ergebnisse homozygot deletierter Bdp1-Embryonen. Da zwei Patienten zusätzlich zur SMA eine Gehirnatrophie entwickelten, sollte ein Bdp1-knockout im Zentralnervensystem (ZNS) generiert werden. Dieser wurde mit Hilfe einer transgenen Nestin-Cre-Linie induziert und führte bei Bdp1fl/fl; Nestintg/wt-Embryonen erst zu einer Wachstumsverzögerung und anschließend zu einer embryonalen Letalität zwischen E18.5 p.c. und P1. HE-gefärbte Übersichtspräparate von Embryonen entsprechender Genotypen zeigten ein stark erweitertes Ventrikelsystem mit rudimentär angelegten Bereichen von Cerebellum, Diencephalon und Mesencephalon. Mittels immunhistologischer Färbungen wurde eine erhöhte Anzahl an apoptotischen Zellen in den Lateralventrikeln nachgewiesen. Der homozygote Verlust des Bdp1-Gens führte wahrscheinlich sekundär zur Ausbildung eines Hydrocephalus. Somit nahm das Bdp1-Protein eine wichtige Funktion innerhalb der frühen Gehirnentwicklung ein. Schließlich wurden Bdp1ko/wt-Tiere mit SMA-Tieren (Smnko/ko; SMN2tg/tg) verpaart, um den Einfluss von Smn-Deletionen auf Bdp1-Expressionen näher zu untersuchen. Zusammenfassend konnte der Zusammenhang zwischen einer BPD1-Haploinsuffizienz und dem Auftreten einer Gehirnatrophie nicht gezeigt werden. Jedoch nimmt die TFIIIB-Untereinheit Bdp1 selbst eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung und speziell während der Entwicklung des ZNS ein. Das konditionale Bdp1-Mausmodell bietet weitere Möglichkeiten, die Funktionen des Bdp1-Gens in vivo zu untersuchen.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    B double prime 1 (BDP1, TFNR) is a subunit of the transcription factor IIIB complex which is essential in transcription initiation of small RNAs transcribed by RNA pol III. The BDP1 gene is ubiquitously expressed with notable abundance in the cerebellum. It maps on 5q13, distal to the duplicated region including the spinal muscular atrophy (SMA) determining gene “survival motor neuron gene 1” (SMN1). SMA is an autosomal recessive, neurodegenerative disorder characterized by muscle weakness and atrophy of proximal voluntary muscles. In rare cases SMA patients exhibit additional atypical features such as brain atrophy. These phenotypes have been shown to correlate with large deletions in the SMA region and marker analyses revealed deletions in genes distally to the SMA region including the BDP1. Therefore, we hypothesized that haploinsufficiency of BDP1 may cause brain atrophy. To test this hypothesis we generated conditional Bdp1 knockout mice using the Cre/loxP system. Ubiquitous heterozygous deletion of the Bdp1 allel (Bdp1ko/wt) led to no obvious phenotype. To analyze the potential effect of heterozygous Bdp1 deletion in those animals we isolated RNA and protein from cerebrum and cerebellum of Bdp1wt/wt and Bdp1ko/wt animals and measured the transcript and protein amount of different TFIIIB subunits (Bdp1, Brf1 and Tbp) and of known interaction partners (TFIIIC102, Erk, Myc, p53, Rb) via quantitative realtime-PCR and western blot analysis. Bdp1ko/wt animals showed in both tissues a downregulation of Bdp1 expression of 50 %. Interestingly Tbp was highly decreased on RNA and protein level in cerebellum of Bdp1ko/wt animals indicating an important role of Bdp1 in this brain area. Furthermore, transcript and protein amount of all TFIIIB subunits and interaction partners were decreased indicating that Bdp1 influences proteins interacting with TFIIIB. Via northern blot analysis increased expression of the RNA pol III-dependent gene U6 snRNA were measured in cerebellum of Bdp1ko/wt animals. In contrast, the results of the realtime-PCR and western blot analysis of Bdp1wt/wt and Bdp1ko/wt animals were not confirmed with mouse embryonic fibroblasts (MEF) heterozygously deleted for Bdp1, in which most of the interaction partners showed a transcriptional upregulation. These results indicate a possible development- or tissue-specific gene regulation. The ubiquitous homozygous deletion of Bdp1 resulted in embryonic lethality before nidation (E2,5 p.c.). In vitro cultured Bdp1ko/ko embryos (E3,5 p.c.) presented fragmented inner cell mass and massive shrinkage, indicating an important role for Bdp1 during very early development. To analyze the effect of Bdp1 deficiency in an in vitro model we generated homozygously floxed MEF (Bdp1fl/fl) and deleted Bdp1 using recombinant Cre (HTN-Cre). One week after treatment most of the cells died. A decreased cell viability of homozygously deleted MEF was shown via MTT assay which confirmed the data of homozygous Bdp1 knockout embryos. Since two patients with atypical SMA exhibited brain atrophy, the effect of a Bdp1 deficiency in the central nervous system (CNS) was of particular interest. Neuronal specific knockout of Bdp1 using Nestin-Cre transgenic mice caused growth retardation and embryonic lethality of Bdp1fl/fl; Nestintg/wt embryos between E18,5 p.c. and postnatal day 1 (P1). HE staining of Bdp1fl/fl; Nestintg/wt embryos revealed vastly dilated lateral ventricles. Furthermore cerebellum, diencephalon and mesencephalon could be detected only rudimentarily. Immunohistological analysis of the embryos revealed an increased number of apoptotic cells within the ventricular zone of the lateral ventricles. Taken together these results suggest that homozygous loss of Bdp1 led secondary to development of a hydrocephalus and point towards an essential role of Bdp1 during brain development. Finally, we crossbred Bdp1ko/wt-animals to an SMA mouse model to find out whether Smn knockouts influence Bdp1 expression. Taken together the hypothesis that BDP1 haploinsufficiency caused brain atrophy could not be confirmed. Nevertheless the results of this work indicate an essential role of the TFIIIB subunit Bdp1 during embryonic development per se and in CNS development in particular. The conditional Bdp1 knockout mouse provides further possibilities to analyze Bdp1 function in vivo.English
    Creators:
    CreatorsEmail
    Jakubik, MiriamMiriamJakubik@web.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-43655
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    RNA Polymerase III (RNA Pol III)German
    Transkriptionsfaktor IIIB (TFIIIB)German
    Proximale Spinale Muskelatrophie (SMA)German
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > Institut für Genetik
    Language: German
    Date: 02 May 2011
    Date Type: Completion
    Date of oral exam: 30 June 2011
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 14 Oct 2011 08:51:35
    Referee
    NameAcademic Title
    Korsching, SigrunProf. Dr. rer. nat.
    Wirth, BrunhildeProf. Dr. rer. nat.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4365

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