Universität zu Köln

Bruehl, Natalie (2015). Charakterisierung des Fructoseexports in Corynebacterium glutamiucm. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Corynebacterium glutamicum ist einer der bedeutendsten Mikroorganismen der industriellen Biotechnologie. Bei der biotechnologischen Herstellung von Aminosäuren durch C. glutamicum stellt Saccharose die meist genutzte Kohlenstoffquelle dar. Als Alternative zu reiner Saccharose wird auch Melasse, ein Nebenprodukt der Zuckerherstellung, bei der Produktion von L-Lysin und L-Glutamat durch C. glutamicum kosteneffektiv genutzt. Da C. glutamicum keine Fructokinaseaktivität besitzt, setzt die vollständige Nutzung von Saccharose als Kohlenstoffquelle, den Export und Reimport des entstehenden unphosphorylierten Fructosemoleküls voraus. Der Reimport von Fructose über ein Phosphoenolpyruvat-abhängiges Phosphotransferase System (PTS) geht mit der für die Nutzung des Fructosemoleküls als Kohlenstoffquelle erforderlichen Phosphorylierung einher. Das Vorhandensein eines Exporters für Fructose wurde aufgrund der bisherigen Datenlage zwar angenommen, jedoch auf biochemischer Ebene bisher nicht untersucht und bestätigt. Der Fructoseexporter stellt sowohl ein interessantes Target zur Optimierung von Produktionsstämmen in Richtung der Saccharoseverwertung dar, als auch bei der Entwicklung von genomreduzierten Produktionsstämmen, die als Ziel die Herstellung eines Chassis-Organismus haben, der auf die wichtigsten metabolischen Eigenschaften beschränkt ist. In der vorliegenden Arbeit wurde der Modellstamm C. glutamicum FIMS konstruiert, der die Charakterisierung des Fructoseexports ermöglichte. Der Modellstamm wurde auf Basis von Untersuchungen zur Fructoseaufnahme und zur intrazellulären Umwandlung von Fructose in andere Metabolite konstruiert. Dieser Stamm ist defizient in der Wiederaufnahme von Fructose und der Reduktion von Fructose zu Mannitol, welche den intrazellulären Verlust von Fructose herbeiführen würde. Zur biochemischen Charakterisierung des Fructoseexports wurde eine radiochemische Methode entwickelt, die eine Messung des Exports von Fructose spezifisch ermöglicht. Auf Basis dieser Methode wurde der Export von Fructose mithilfe des Modellstamms charakterisiert. Fructose wird sowohl spezifisch über mindestens zwei Transportproteine, als auch unspezifisch über mechanosensitive Kanäle exportiert. Der spezifische Efflux von Fructose erfolgt höchstwahrscheinlich über facilitated diffusion und mit einer Geschwindigkeitskonstanten k von 0,109 ± 0,025 min-1. Als Hauptexportsystem von Fructose wurde der MFS-Transporter Cg0772 identifiziert, welcher mit 60-80% am spezifischen Export beteiligt ist. Darüber hinaus ist mindestens ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Transportsystem am spezifischen Efflux beteiligt. Anhand der erlangten Daten zum Fructoseexport wurde ein kinetisches Modell erstellt, welches die Modellierung des Fructoseefflux ermöglichte und somit zur Unterstützung der Datenanalyse herangezogen wurde. Damit trug das Modell signifikant zum Verständnis des Fructoseefflux bei.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Characterization of Fructose Export in Corynebacterium glutamiucm English
Translated abstract:	Abstract Language As one of the most important microorganisms in biotechnology, Corynebacterium glutamicum is widely used for the industrial production of amino acids. As carbon source for fermentation processes, sucrose is predominantly applied. For the production of L-lysine and L-glutamate by C. glutamicum, Sucrose is used cost efficiently as molasses, a by-product of the refining of sugarcane or sugar beets into sugar. C. glutamicum does not possess fructokinase activity. Following to sucrose uptake, phosphorylation and hydrolysis, complete sucrose utilization implies export and reuptake of the liberated unphosphorylated fructose. Fructose is imported over a phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS), which couples uptake and concomitant phosphorylation. Based on previous data the existence of a fructose export system was assumed, but not biochemically proven. The respective fructose-transporter would be an interesting target, not only for metabolic engineering towards efficient sucrose utilization, but also for development of a genome-reduced production strain, that aims design of a chassis-organism reduced to the most important metabolic features. Within the present study a model strain was constructed, C. glutamicum FIMS, which allowed characterization of fructose export. This strain was constructed based on analyses of fructose-import characteristics and intracellular conversion of fructose to other metabolites. The model strain was deficient in fructose uptake as well as in the ability of the reduction from fructose to mannitol, which otherwise causes loss of fructose by an alternative pathway. For biochemical export-characterization a radiochemical method was developed, which allows specific measurement of fructose export. By combining this method together with the constructed C. glutamicum model strain, fructose was found to be excreted by at least two specific transporters, as well as by unspecific efflux via mechanosensitive channels. Specific fructose efflux occurs most likely by facilitated diffusion showing a first-order rate constant of 0.109 ± 0.025 min-1. As the main contributor to fructose export the MFStransporter Cg0772 was identified. Cg0772 participates with 60-80% to specific fructose export. Furthermore, minimum one additional, so far non characterized export system is involved in specific export of fructose. By means of the data obtained a kinetic model was developed, which allowed modelling of fructose efflux. This model supported data analysis and contributed significantly to the understanding of fructose efflux kinetics. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bruehl, Natalie natalie-bruehl@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-62277
Date:	7 July 2015
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium German Fructose German Transport German
Date of oral exam:	7 July 2015
Referee:	Name Academic Title Kraemer, Reinhard Prof. Dr. Fluegge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/6227