Universität zu Köln

Ribonukleinsäuren (RNAs), insbesondere Boten-RNAs (mRNAs), haben das Potenzial, in der künftigen therapeutischen Forschung eine führende Rolle zu spielen. Während der SARS-CoV-2 Pandemie haben sich mRNA-Impfstoffe als nützlich und hochwirksam erwiesen. Daher ist es von großem Interesse, RNA weiter zu erforschen und das derzeitige Wissen über Funktion, Struktur sowie Modifikationen an RNA und deren Auswirkungen auszubauen. Die Erweiterung des genetischen Alphabets durch die Verwendung unnatürlicher Basen (UB) kann dazu beitragen, sowohl durch die Modifizierung der RNA als auch durch die Gewinnung neuer Erkenntnisse aus der modifizierten RNA. In dieser Arbeit wurden unnatürliche Basenmodifikationen für die ortsspezifische Einführung unterschiedlicher Funktionalitäten in verschiedene RNA-Sequenzen genutzt. Es wurde ein wertvoller Beitrag zur Strukturaufklärung der nicht kodierenden und komplex gefalteten regulatorischen Xist A-Wiederholungsregion geleistet. Hierbei ermöglichte der Einbau von UB gebundenen Nitroxid-Spin-Sonden die Messung des Inter-Spin-Abstands. So wurde mithilfe von verschiedenen, gezielten Markierungspositionen eine zuvor vorgeschlagene Struktur bestärkt. Für proteinkodierende mRNA-Sequenzen mit Cyclopropen (CP)-funktionalisierten UB Modifikationen in ihren 3′-untranslatierten Regionen, wurden vielfältige Analysen zellulärer Anwendungen vorgestellt. Unter Verwendung der Klickchemie von Diels-Alder-Reaktionen mit inversem Elektronenbedarf ermöglichte die Markierung CP-modifizierter mRNAs mit Tetrazin-konjugierten Fluorophoren eine hervorragende räumlich-zeitliche Visualisierung der mRNA in Zellen. Darüber hinaus wurden hochgradig modifizierte mRNA-Sequenzen mit einer Kombination aus ortsspezifischen unnatürlichen und zufällig positionierten natürlichen Basenmodifikationen auf ihren Einfluss auf die mRNA-Stabilität und mRNA-Funktionalität hin untersucht. Es wurde eine kombinierte zeitliche Quantifizierung der zellulären mRNA-Spiegel und der zellulären Expression des mRNA-kodierten Reporterproteins durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Kombination von unnatürlichen und natürlichen Basenmodifikationen sowohl die mRNA-Stabilität in den Zellen als auch die zelluläre Proteinexpression durch eine hervorragende mRNA-Translationseffizienz synergistisch verbessert. UB-Modifikationen erwiesen sich als vorteilhaft für die Forschung sowohl an kodierender als auch an nicht-kodierender RNA. Darüber hinaus erleichterten ortsspezifische UB Modifikationen nicht-disruptive Untersuchungen zu verschiedenen Parametern wie Struktur, Funktion und Visualisierung von RNA. Die in dieser Arbeit entwickelten Anwendungen und Methoden werden zu zukünftiger RNA-Forschung und therapeutischer Entwicklung unterstützend beitragen.

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