Universität zu Köln

Bornewasser, Lisa ORCID: 0000-0002-3890-107X (2022). Developing new methods for specific RNA modification. PhD thesis, Universität zu Köln.

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• Developing new methods for specific RNA modification. (deposited 31 Mar 2023 08:55) [Currently Displayed]

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Abstract

Ribonucleic acids (RNAs), and messenger RNAs (mRNAs) in particular, have the potential to play a leading role in future therapeutic research. During the SARS-CoV-2 pandemic, mRNA vaccines have proven useful and highly effective. Therefore, it is of great interest to further investigate RNA and to broaden the current knowledge about RNA function, structure as well as modifications and their effects. Expansion of the genetic alphabet by use of unnatural bases (UB) can contribute to this, both by modifying RNA and extracting new information from the modified RNA. In this thesis, unnatural base modifications were utilized for site-specific introduction of various functionalities into different RNA sequences. A valuable contribution was made towards structure elucidation of the non-coding and complex folded regulatory Xist A repeat region. Here, incorporation of UB-attached nitroxide spin labels enabled inter-spin distance measurements and thus support for a previously proposed structure by targeting different labeling positions. Multifaceted analysis of cellular applications was presented for protein coding mRNA sequences carrying cyclopropene (CP)-functionalized UB modifications in their 3′-untranslated regions. Employing inverse electron demand Diels-Alder click chemistry, live-cell labeling of CP-modified mRNAs with tetrazine-conjugated fluorophores allowed excellent spatiotemporal mRNA visualization in cells. In addition, highly modified mRNA sequences with a combination of site-specific unnatural and random positioned natural base modifications were investigated regarding their influence on mRNA stability and functionality. A combined temporal quantification was performed for cellular mRNA levels and cellular expression of the mRNA encoded reporter protein. The combination of unnatural and natural base modifications was shown to synergistically improve both mRNA stability in cells and cellular protein expression through outstanding mRNA translation efficiency. Briefly, UB modifications proved advantageous for research on both coding and non-coding RNA. Moreover, site-specific UB modifications facilitated non-disruptive investigations on different parameters such as structure, function and visualization of RNA. The applications and methods developed in this thesis will support future RNA research and therapeutic development.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Ribonukleinsäuren (RNAs), insbesondere Boten-RNAs (mRNAs), haben das Potenzial, in der künftigen therapeutischen Forschung eine führende Rolle zu spielen. Während der SARS-CoV-2 Pandemie haben sich mRNA-Impfstoffe als nützlich und hochwirksam erwiesen. Daher ist es von großem Interesse, RNA weiter zu erforschen und das derzeitige Wissen über Funktion, Struktur sowie Modifikationen an RNA und deren Auswirkungen auszubauen. Die Erweiterung des genetischen Alphabets durch die Verwendung unnatürlicher Basen (UB) kann dazu beitragen, sowohl durch die Modifizierung der RNA als auch durch die Gewinnung neuer Erkenntnisse aus der modifizierten RNA. In dieser Arbeit wurden unnatürliche Basenmodifikationen für die ortsspezifische Einführung unterschiedlicher Funktionalitäten in verschiedene RNA-Sequenzen genutzt. Es wurde ein wertvoller Beitrag zur Strukturaufklärung der nicht kodierenden und komplex gefalteten regulatorischen Xist A-Wiederholungsregion geleistet. Hierbei ermöglichte der Einbau von UB gebundenen Nitroxid-Spin-Sonden die Messung des Inter-Spin-Abstands. So wurde mithilfe von verschiedenen, gezielten Markierungspositionen eine zuvor vorgeschlagene Struktur bestärkt. Für proteinkodierende mRNA-Sequenzen mit Cyclopropen (CP)-funktionalisierten UB Modifikationen in ihren 3′-untranslatierten Regionen, wurden vielfältige Analysen zellulärer Anwendungen vorgestellt. Unter Verwendung der Klickchemie von Diels-Alder-Reaktionen mit inversem Elektronenbedarf ermöglichte die Markierung CP-modifizierter mRNAs mit Tetrazin-konjugierten Fluorophoren eine hervorragende räumlich-zeitliche Visualisierung der mRNA in Zellen. Darüber hinaus wurden hochgradig modifizierte mRNA-Sequenzen mit einer Kombination aus ortsspezifischen unnatürlichen und zufällig positionierten natürlichen Basenmodifikationen auf ihren Einfluss auf die mRNA-Stabilität und mRNA-Funktionalität hin untersucht. Es wurde eine kombinierte zeitliche Quantifizierung der zellulären mRNA-Spiegel und der zellulären Expression des mRNA-kodierten Reporterproteins durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Kombination von unnatürlichen und natürlichen Basenmodifikationen sowohl die mRNA-Stabilität in den Zellen als auch die zelluläre Proteinexpression durch eine hervorragende mRNA-Translationseffizienz synergistisch verbessert. UB-Modifikationen erwiesen sich als vorteilhaft für die Forschung sowohl an kodierender als auch an nicht-kodierender RNA. Darüber hinaus erleichterten ortsspezifische UB Modifikationen nicht-disruptive Untersuchungen zu verschiedenen Parametern wie Struktur, Funktion und Visualisierung von RNA. Die in dieser Arbeit entwickelten Anwendungen und Methoden werden zu zukünftiger RNA-Forschung und therapeutischer Entwicklung unterstützend beitragen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bornewasser, Lisa lisa.bornewasser@gmail.com orcid.org/0000-0002-3890-107X UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-652976
Date:	17 December 2022
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Organic Chemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Chemistry and allied sciences Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language nucleic acids English unnatural base modifications English natural base modifications English mRNA English lncRNA English site-specific functionalization English click labeling English
Date of oral exam:	7 March 2023
Referee:	Name Academic Title Kath-Schorr, Stephanie Prof.'in Dr. Neundorf, Ines Prof.'in Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/65297