Universität zu Köln

Improving safety and establishing episomal maintenance of Adeno-associated viral vectors

Schnödt, Maria Angelika (2016) Improving safety and establishing episomal maintenance of Adeno-associated viral vectors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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    Abstract

    Adeno-associated viral (AAV) vectors are among the most widely used gene transfer systems in basic and pre-clinical research and have been employed in more than 160 clinical trials. AAV vectors are commonly produced in producer cell lines like HEK293 by co-transfection with a so-called vector plasmid and one (in this work) or two so-called helper plasmids. The vector plasmid contains the transgene cassette of interest (TEC) flanked by AAV’s inverted terminal repeats (ITRs) which serve as packaging signals, whereas the helper plasmid provides the required AAV and helper virus functions in trans. A pivotal aspect of AAV vectorology is the manufacturing of AAV vectors free from impurities arising during the production process. These impurities include AAV vector preparations that contain capsids containing prokaryotic sequences, e.g. antibiotic resistance genes originating from the producer plasmids. In the first part of the thesis we aimed at improving the safety of AAV vectors. As we found that encapsidated prokaryotic sequences (using the ampicillin resistance gene as indicator) cannot be re-moved by standard purification methods we investigated whether the producer plasmids could be replaced by Minicircles (MCs). MCs are circular DNA constructs which contain no functional or coding prokaryotic sequences; they only consist of the TEC and a short sequence required for production and purification. MC counterparts of a vector plasmid encoding for enhanced green fluorescent (eGFP) protein and a helper plasmid encoding for AAV serotype 2 (AAV2) and helper Adenovirus (Ad) genes were designed and produced by PlasmidFactory (Bielefeld, Germany). Using all four possible combinations of plasmid and MCs, single-stranded AAV2 vectors (ssAAV) and self-complementary AAV vectors (scAAV) were produced and characterized for vector quantity, quality and functionality. The analyses showed that plasmids can be replaced by MCs without decreasing the efficiency of vector production and vector quality. MC-derived scAAV vector preparations even exceeded plasmid-derived preparations, as they displayed up to 30-fold improved transduction efficiencies. Using MCs as tools, we found that the vector plasmid is the main source of encapsidated prokaryotic sequences. Remarkably, we found that plasmid-derived scAAV vector preparations contained a much higher relative amount of prokaryotic sequences (up to 26.1 %, relative to TEC) compared to ssAAV vector preparations (up to 2.9 %). By replacing both plasmids by MCs the amount of functional prokaryotic sequences could be decreased to below the limit of quantification. Additional analyses for DNA impurities other than prokaryotic sequences showed that scAAV vectors generally contained a higher amount of non-vector DNA (e.g. adenoviral sequences) than ssAAV vectors. For both, ssAAV and scAAV vector preparations, MC-derived vectors tended to contain lower amounts of foreign DNA. None of the vectors tested could be shown to induce immunogenicity. In summary we could demonstrate that the quality of AAV vector preparations could be significantly improved by replacing producer plasmids by MCs. Upon transduction of a target tissue, AAV vector genomes predominantly remain in an episomal state, as duplex DNA circles or concatemers. These episomal forms mediate long-term transgene expression in terminally differentiated cells, but are lost in proliferating cells due to cell division. Therefore, in the second part of the thesis, in cooperation with Claudia Hagedorn and Hans J. Lipps (University Witten/Herdecke) an AAV vector genome was equipped with an autonomous replication element (Scaffold/matrix attachment region (S/MAR)). AAV-S/MAR encoding for eGFP and a blasticidin resistance gene and a control vector with the same TEC but lacking the S/MAR element (AAV-ΔS/MAR) were produced and transduced into highly proliferative HeLa cells. Antibiotic pressure was employed to select for cells stably maintaining the vector genome. AAV-S/MAR transduced cells yielded a higher number of colonies than AAV-ΔS/MAR-transduced cells. Colonies derived from each vector transduction were picked and cultured further. They remained eGFP-positive (up to 70 days, maximum cultivation period) even in the absence of antibiotic selection pressure. Interestingly, the mitotic stability of both AAV-S/MAR and control vector AAV-ΔS/MAR was found to be a result of episomal maintenance of the vector genome. This finding indicates that, under specific conditions such as the mild selection pressure we employed, “common” AAV vectors persist episomally. Thus, the S/MAR element increases the establishment frequency of stable episomes, but is not a prerequisite.

    Item Type: Thesis (PhD thesis)
    Translated abstract:
    AbstractLanguage
    Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren sind eine der am häufigsten verwendeten Gentransfersysteme in der Grundlagen- und der präklinischen Forschung und wurden bereits in mehr als 160 klinischen Studien angewendet. Üblicherweise werden sie durch Kotransfektion eines sogenannten Vektorplasmids und zweier, oder wie in meiner Arbeit, eines Helferplasmids in einer Produktionszelllinie hergestellt. Das Vektorplasmid enthält die Transgenexpressionskassette („transgene cassette of interest“ (TEC)) flankiert von den viralen „inverted terminal repeats“ (ITRs), palindromischen Sequenzen, die als Verpackungssignale fungieren, während das Helferplasmid die notwendigen AAV- und Helfervirusgene in trans bereitstellt. Ein entscheidender Aspekt der AAV-Vektorologie ist die Herstellung von AAV-Vektoren frei von durch den Produktionsprozess anfallenden Unreinheiten. Zu diesen Unreinheiten gehören AAV-Kapside, die prokaryotische Sequenzen wie z.B. antibiotische Resistenzgene enthalten, die von den Ausgangsplasmiden stammen. Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Verbesserung der Sicherheit von AAV-Vektoren. Da es nicht möglich ist, in AAV-Kapside verpackte prokaryotische Sequenzen durch Standard-Reinigungsprotokolle zu entfernen, wurde untersucht, ob die Ausgansplasmide für die Vektorproduktion durch „Minicircles“ (MCs) ersetzt werden können. MCs sind zirkuläre DNS-Konstrukte die keine funktionalen oder kodierenden prokaryotischen Sequenzen beinhalten; sie bestehen nur aus der TEC und einem kurzen Abschnitt der für ihre Herstellung und Aufreinigung nötig ist. Ein Vektor-MC als Gegenstück für ein Vektorplasmid das für das enhanced green fluorescent (eGFP) Protein kodiert und ein Helfer-MC als Gegenstück für das Helferplasmid welches für die Gene von AAV Serotyp 2 (AAV2) und die Gene des Helfervirus Adenovirus Typ 5 kodiert, wurden von PlasmidFactory (Bielefeld, Germany) entwickelt und produziert. Die vier möglichen Kombinationen von MCs und Plasmiden wurden anschließend verwendet, um einzelsträngige („single-stranded“) AAV2-Vektoren (ssAAV) und self-complementary” AAV-Vektoren (scAAV) herzustellen. Die Vektorpräparationen wurden gemäß Vektorquantität, –qualität und –funktionalität charakterisiert. Diese Analysen zeigten, dass die Vektor- und Helferplasmide durch MCs ersetzt werden können, ohne die Effizienz der Vektorproduktion oder die Vektorqualität zu verringern. MC-basierte scAAV-Vektorpräparationen wiesen im Vergleich zu Plasmid-basierten Präparationen sogar eine bis zu 30-fach verbesserte Transduktionseffizienz auf. Durch Verwendung der verschiedenen Kombinationen von Plasmiden und MCs konnte das Vektorplasmid als Hauptquelle der falsch in Kapside verpackten prokaryotischen Sequenzen identifiziert werden. Bemerkenswerterweise beinhalteten die Plasmid-basierten scAAV-Vektorpräparationen eine beträchtlich höhere Menge prokaryotischer Sequenzen (bis zu 26,1 %, im Verhältnis zur TEC) als ssAAV-Vektorpräparationen (bis zu 2,9 %). Durch Ersetzen beider Plasmide durch MC wurde die Menge an kodierenden prokaryotischen Sequenzen unter die Nachweisgrenze reduziert. Weitere Analysen zeigten, dass scAAV-Vektoren im Allgemeinen einen höheren Anteil weiterer DNS-Unreinheiten (wie z.B. adenovirale Sequenzen) als ssAAV-Vektoren aufwiesen. Sowohl ssAAV- als auch scAAV-Vektorpräparationen die mit MCs hergestellt wurden tendierten dazu, kleinere Mengen Fremd-DNS zu beinhalten als Vektorpräparationen die mit Plasmiden hergestellt wurden. Keine der getesteten Vektorpräparationen induzierte Immunogenität. Somit lässt sich zusammenfassend sagen, dass die Qualität von AAV-Vektorpräparationen signifikant verbessert wird, wenn statt Plasmiden MCs zur Herstellung verwendet werden. Nach erfolgreicher Zelltransduktion bilden die AAV-Vektorgenome überwiegend doppelsträngige DNS-Ringe oder DNS-Konkatemere aus. Diese episomalen Moleküle persistieren in post-mitotischen Zellen und vermitteln so langfristige Transgenexpression, gehen jedoch in proliferierenden Zellen mit fortschreitender Zellteilung verloren. Für den zweiten Teil dieser Arbeit wurde, in Kooperation mit Claudia Hagedorn und Hans J. Lipps (Universität Witten/Herdecke), ein AAV-Vektor mit einem autonom replizierenden Element (Scaffold/matrix attachment region (S/MAR)) ausgestattet. Vektor AAV-S/MAR, kodierend für eGFP und ein Blasticidin-Resistenzgen und ein Kontrollvektor mit der gleichen TEC, aber ohne das S/MAR-Element wurden produziert und in schnell proliferierende HeLa-Zellen transduziert. Durch Inkubation mit dem Antibiotikum Blasticidin wurden die Zellen selektioniert die das Vektorgenom stabil bewahrten. AAV-S/MAR-transduzierte Zellen wiesen eine höhere Anzahl an überlebenden Zellkolonien auf als AAV-ΔS/MAR-transduzierte Zellen. Zellkolonien beider Vektoren wurden isoliert und kultiviert. Sie blieben bis zu 70 Tage (maximaler Kultivierungszeitraum) eGFP-positiv – ohne Selektionsdruck durch Antibiotikagabe. Erstaunlicherweise war die mitotische Stabilität sowohl von AAV-S/MAR als auch des Kontrollvektors AAV-ΔS/MAR ein Resultat episomaler Persistenz des jeweiligen Vektorgenoms. Diese Ergebnisse lassen die Annahme zu, dass „gewöhnliche“ AAV-Vektorgenome unter spezifischen Bedingungen, wie durch den verwendeten milden Selektionsdruck, episomal persistieren können. Unter diesen Umständen erhöht das S/MAR-Element die Häufigkeit der Etablierung des stabilen Episoms, ist aber keine Grundvoraussetzung.German
    Creators:
    CreatorsEmail
    Schnödt, Maria Angelikamaria.schnoedt@posteo.de
    URN: urn:nbn:de:hbz:38-70982
    Subjects: Life sciences
    Uncontrolled Keywords:
    KeywordsLanguage
    Adeno-associated viral vectorEnglish
    MinicircleEnglish
    Scaffold/matrix attachment regionEnglish
    Faculty: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
    Divisions: Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät > ZMMK
    Language: English
    Date: 2016
    Date Type: Publication
    Date of oral exam: 24 October 2016
    Full Text Status: Public
    Date Deposited: 03 Jan 2017 11:28:36
    Referee
    NameAcademic Title
    Mörsdorf , DagmarProf. Dr.
    Uhlirova, MirkaProf. Dr.
    Büning, HildegardProf. Dr.
    URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/7098

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