Universität zu Köln

Das Protein TAU ist ein neuronales Protein, das die Stabilität und Polymerisierung von Mikrotubuli (MT) reguliert. TAU ist normalerweise überwiegend im Axon lokalisiert, kann jedoch unter pathologischen Bedingungen in das somatodendritische Kompartiment fehlsortiert werden. Diese Fehlverlagerung stellt einen frühen Schritt in der pathophysiologischen Kaskade von Tauopathien dar, zu denen unter anderem die Alzheimer-Krankheit (AD) und die frontotemporale Demenz (FTD) zählen. Fehlverteiltes TAU führt im weiteren Verlauf zu einer Destabilisierung von Mikrotubuli, Störungen des axonalen Transports, synaptischer Toxizität und letztlich zu Neurodegeneration. Um TAU-Fehlsortierung gezielt entgegenzuwirken, müssen die physiologischen Sortierungsmechanismen verstanden werden, die eine Anreicherung von TAU im Axon ermöglichen. Das Axon-Initialsegment (AIS) ist eine spezialisierte Struktureinheit im proximalen Axon, die eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität – also der Trennung des axonalen und dendritischen Kompartiments – einnimmt. Daher wurde das AIS als möglicher Regulator der axonalen TAU-Sortierung vorgeschlagen. Darüber hinaus ist die Untersuchung des neuronalen MT-Netzwerks von zentraler Bedeutung, da es zum einen ebenfalls an verschiedenen Mechanismen der TAU-Sortierung beteiligt ist und zum anderen selbst direkt von TAU-Fehlsortierung betroffen ist. Bislang wurden sowohl neuronale Polarisierung (inklusive AIS-Etablierung, MT-Struktur und TAU-Verteilung) als auch physiologische und pathologische TAU-Funktionen hauptsächlich in primären Nagetierneuronen und Tauopathie-Mausmodellen untersucht. Aufgrund verschiedener Einschränkungen dieser Modelle (insb. unterschiedliche TAU-Isoformen und Sequenzen, Überexpressionsartefakte, fehlende endogene Tau-Pathologie) lassen sich viele der beschriebenen Mechanismen jedoch nicht auf das menschliche zentrale Nervensystem (ZNS) übertragen, was sich auch in den bislang geringen therapeutischen Erfolgen im Bereich der Tauopathien widerspiegelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Etablierung eines humanen Zellmodells, das eine zuverlässige Modellierung der TAU-Sortierung, AIS-Bildung und MT-Organisierung erlaubt und sich sowohl für die Untersuchung physiologischer als auch pathologischer TAU-Funktionen eignet. Zudem untersuchten wir den Beitrag des AIS zur axonalen TAU-Sortierung mit besonderem Fokus auf zwei zentralen AIS-Proteinen: (a) Ankyrin G (ANKG), dem Hauptorganisator des AIS, und (b) TRIM46, einem AIS-spezifischen Protein der Mikrotubuli-Organisation. Dazu setzten wir aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Neuronen sowie neuronal differenzierte humane SH-SY5Y-Neuroblastomzellen ein und verglichen sie mit primären Mausvorderhirnneuronen, die ein etabliertes Modell für neuronale Polarisierung und AIS-Studien darstellen. Unsere Analysen mittels Immunfluoreszenz und qPCR zeigen, dass iPSC-abgeleitete Neuronen innerhalb der ersten ~40 μm des Axons ein typisches AIS ausbilden, gekennzeichnet durch die synchrone Akkumulation und Kolokalisation von ANKG und TRIM46. Die vollständige Integration dieser Proteine in das proximale Axon benötigte rund 1,5 Wochen und korrelierte mit der fortschreitenden Anreicherung axonalen TAUs sowie der strukturellen Polarisierung der iPSC-Neuronen. Die AIS-Struktur, neuronale Polarisierung und TAU-Sortierung waren mit denen primärer Mausneuronen vergleichbar. Im Gegensatz dazu fehlte SH-SY5Y-Neuronen ANKG und damit ein klassisches AIS. Zwar exprimierten sie nach neuronaler Differenzierung TRIM46, jedoch in geringerem Maße als iPSC- und Mausneuronen. Dennoch erreichten auch AIS-defiziente SH-SY5Y-Neuronen zelluläre Polarität und eine axonale TAU-Verteilung, wenn auch mit reduzierter Effizienz. Darüber hinaus etablierten wir ein Protokoll zur Visualisierung von Mikrotubuli-Polymerisierung in iPSC- und SH-SY5Y-Neuronen mittels EB3-Live-Cell-Imaging. Dadurch konnten wir das MT-Netzwerk von iPSC- und SH-SY5Y-Neuronen im proximalen und distalen Axon sowie in den Dendriten analysieren. Beide Zelltypen zeigten die für differenzierte Neuronen typische MT-Polarisierung: unidirektionale MTs im Axon (~95 % Plus-Ende der MTs nach außen) und gemischte Polarität in Dendriten (~75 % Plus-Ende der MTs nach außen). SH-SY5Y-Zellen wiesen dynamischere MTs auf, während die Polymerisationsgeschwindigkeit in beiden humanen Zelltypen ähnlich war und deutlich höher lag als in verschiedenen Tiermodellen aus früheren Studien. Um die funktionelle Rolle von ANKG und TRIM46 weiter zu prüfen, wurden ergänzend shRNA-Knockdown-Experimente in iPSC-Neuronen mittels liposomaler Transfektion und lentiviraler Transduktion durchgeführt. Zwar ließ sich die lentivirale Transduktion insgesamt als effiziente Methode zur Expression von shRNA und Reportergenen in iPSC-Neuronen etablieren, ein spezifischer Knockdown der AIS-Proteine wurde jedoch nicht erreicht, was vermutlich auf methodische Limitationen im shRNA-Design, die Langlebigkeit der AIS-Proteine oder mögliche Off-Target-Effekte zurückzuführen ist. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse jedoch darauf hin, dass die MT-Polarisierung und die axonale TAU-Sortierung nicht primär von ANKG abhängen, da diese Prozesse regelhaft in SH-SY5Y-Neuronen stattfanden. Stattdessen scheint TRIM46, wie in vorherigen Studien gezeigt, die anterograde MT-Ausrichtung im Axon zu steuern und könnte damit die Anreicherung von TAU durch aktiven Transport ermöglichen. ANKG hingegen trägt offenbar in reifen Neuronen eher zur Aufrechterhaltung der Polarität und neuronalen Erregbarkeit bei, ohne die axonale TAU-Anreicherung direkt zu beeinflussen. Während SH-SY5Y-Zellen ein praktikables und leicht zu vermehrendes Modell für grundlegende Studien zu MT-Dynamik und TAU-Sortierung darstellen, bieten iPSC-abgeleitete Neuronen bessere Voraussetzungen für vertiefte TAU-Studien, die etwa das AIS, synaptische Interaktionen oder isoformspezifische TAU-Funktionen einbeziehen. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit (a) quantitative Parameter zu AIS-Aufbau, MT-Dynamik und TAU-Sortierung in zwei humanen Zellmodellen etabliert, (b) ein Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Polymerisierung in lebenden menschlichen Neuronen mittels EB3-Live-Cell-Imaging entwickelt, (c) gezeigt, dass MT-Polarisierung und basale axodendritische TAU-Polarität unabhängig von ANKG möglich sind, und (d) iPSC-Neuronen als geeignetes Modell für die Erforschung neuronaler Polarisierung und TAU-(Fehl)sortierung hervorgehoben, welches vielfältige Anwendungen in der Tauopathieforschung ermöglicht.

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