Cinko, Muhammed Talha ORCID: 0000-0001-8503-9120 (2026). Molecular and Functional Characterisation of Lysine-11-Linked Ubiquitination in Pattern Recognition Receptor Signalling. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Identification Number:10.1038/s41556-026-01886-z

Abstract

Pattern recognition receptor (PRR)-mediated interferon (IFN) production is essential for host defence against invading pathogens. Among PRRs, Toll-like receptor 3 (TLR3), TLR4, Retinoic Acid-Inducible Gene I (RIG-I) / Mitochondrial Antiviral-Signalling (MAVS) and the cyclic GMP–AMP synthase–stimulator of interferon genes (cGAS–STING) pathways signal through TANK-binding kinase 1 (TBK1), which activates the transcription factor IFN regulatory factor 3 (IRF3) via its phosphorylation, thereby inducing type I and type III IFN production. Beyond its role in innate immune signalling, TBK1 also functions within the TNF pathway, where it phosphorylates receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1) to suppress cell death. Previous studies demonstrated that TBK1 recruitment to the TNF receptor 1 signalling complex (TNFR1-SC) depends on the linear ubiquitin ligase activity of HOIP, which promotes the recruitment of NEMO and subsequent association of TBK1 through the adaptor proteins TRAF family member-Associated NF-κB Activator (TANK), NAK-Associated Protein 1 (NAP1). However, the molecular mechanisms governing TBK1 recruitment and activation downstream of PRRs have remained poorly understood. This study identifies lysine 11-linked ubiquitin chains (K11-Ub) as critical regulators of TBK1 activation downstream of TLR3, TLR4, and cGAS–STING signalling, but not the RIG-I/MAVS pathway. The RBR E3 ubiquitin ligase Ankyrin repeat and IBR domain-containing protein 1(ANKIB1) catalyses the formation of K11-linked ubiquitin chains on components of the TLR3- and cGAS–STING-associated signalosomes, thereby promoting the recruitment of Optineurin (OPTN), while not affecting the recruitment of TANK, NAP1, or Similar to NAP1 TBK1 Adaptor (SINTBAD). OPTN recruitment subsequently enables TBK1 activation, defining a previously unrecognized signalling axis. Mechanistically, ANKIB1 is recruited to the respective signalling complexes through its ubiquitin-interacting motif (UIM), where it mediates K11-linked ubiquitination of TRIF, OPTN, NEMO, and STING. ANKIB1 itself also undergoes auto-ubiquitination under basal conditions, which is further enhanced following TLR3 or STING activation. Importantly, the RING1, but not RING2, domain of ANKIB1, is required for these ubiquitination events and for subsequent TBK1 activation unlike other RBR group E3 ligases. In addition, loss of ANKIB1 severely impairs TBK1/IRF3 activation, and subsequent IFN production, following TLR3/4 cGAS–STING stimulation. In contrast, RIG-I/MAVS-dependent signalling and IFN induction remain unaltered. Biochemical analyses revealed that RIG-I/MAVS signalling primarily relies on TANK, NAP1, and SINTBAD for TBK1 activation, whereas TLR3/4- and cGAS–STING-mediated TBK1 activation is governed by OPTN, establishing ANKIB1 as a central regulator of TBK1 activation in OPTN-dependent PRR pathways. In vivo studies further manifested that ANKIB1 deficiency attenuates IFN production downstream of TLR3 signalling, thereby alleviating interferonopathy and improving survival in a secondary haemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) model. Conversely, ANKIB1 depletion compromises type I IFN responses and antiviral immunity, resulting in increased susceptibility to herpes simplex virus 1 (HSV-1) infection, which primarily activates cGAS–STING signalling. Collectively, these findings reveal an unexpected and indispensable role for K11-linked ubiquitin signalling in PRR-mediated IFN production and immune responses, both in vitro and in vivo.

Item Type: Thesis (PhD thesis)
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Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Lysin-11-verknüpften Ubiquitinierung in der Signalübertragung von Mustererkennungsrezeptoren
German
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Die durch Mustererkennungsrezeptoren (PRR) vermittelte Interferon (IFN)-Produktion ist für die Abwehr eindringender Krankheitserreger durch den Wirt von entscheidender Bedeutung. Zu den PRRs gehören der Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), TLR4, Retinsäure-induzierbares Gen-I (RIG-I)/ Mitochondrialer Antiviraler-Signalweg (MAVS) sowie die zyklische GMP–AMP Synthase–Stimulator-von-Interferon-Genen (cGAS-STING)-Signalwege. Diese Signalwege vermitteln ihre Signale über die TANK-bindende Kinase 1 (TBK1), welche den Transkriptionsfaktor IFN-Regulationsfaktor 3 (IRF3) durch dessen Phosphorylierung aktiviert und dadurch die Produktion von Typ-I- und Typ-III-IFN induziert. Neben seiner Rolle in der angeborenen Immunantwort ist TBK1 auch im TNF-Signalweg aktiv, wo es die Rezeptor-interagierende Proteinkinase 1 (RIPK1) phosphoryliert und so den Zelltod hemmt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Rekrutierung von TBK1 an den TNF-Rezeptor-1-Signalkomplex (TNFR1-SC) von der linearen Ubiquitin-Ligase-Aktivität von HOIP abhängt. HOIP fördert hierbei die Rekrutierung von NEMO und die anschließende Assoziation von TBK1 über die Adapterproteine TRAF-Familienmitglied-assoziierter NF-κB-Aktivator (TANK) und NAK-assoziiertes Protein 1 (NAP1). Die molekularen Mechanismen, die die Rekrutierung und Aktivierung von TBK1 nach Aktivierung von PRRs steuern, sind jedoch bislang kaum verstanden. Diese Studie identifiziert Lysin-11-verknüpfte Ubiquitinketten (K11-Ub) als entscheidende Regulatoren der TBK1-Aktivierung im Anschluss an die Aktivierung der TLR3-, TLR4- und cGAS-STING-Signalwege, nicht jedoch des RIG-I/ MAVS-Signalwegs. Das RBR-E3-Ubiquitinligase Ankyrin-Repeat- und IBR-Domänen-haltiges Protein 1 (ANKIB1) katalysiert die Bildung von K11-verknüpften Ubiquitinketten an Komponenten der TLR3- und cGAS-STING-assoziierten Signalosomen und fördert dadurch die Rekrutierung von Optineurin (OPTN), ohne jedoch die Rekrutierung von TANK, NAP1 oder dem NAP1-ähnlichen TBK1-Adaptor (SINTBAD) zu beeinflussen. Die OPTN-Rekrutierung ermöglicht anschließend die TBK1-Aktivierung und definiert so einen bisher unbekannten Signalweg. Mechanistisch gesehen wird ANKIB1 über sein Ubiquitin-Interaktionsmotiv (UIM) an die jeweiligen Signalkomplexe rekrutiert, wo es die K11-verknüpfte Ubiquitinierung von TRIF, OPTN, NEMO und STING vermittelt. ANKIB1 selbst unterliegt unter basalen Bedingungen einer Autoubiquitinierung, die nach Aktivierung von TLR3 oder STING weiter verstärkt wird. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu anderen E3-Ligasen der RBR-Familie die RING1-Domäne von ANKIB1 - nicht jedoch die RING2-Domäne - für diese Ubiquitinierungsvorgänge und die anschließende TBK1-Aktivierung erforderlich ist. Darüber hinaus beeinträchtigt der Verlust von ANKIB1 die TBK1/ IRF3-Aktivierung und die nachfolgende IFN-Produktion nach TLR3/ 4/ cGAS-STING-Stimulation erheblich. Im Gegensatz dazu bleiben die RIG-I/ MAVS-abhängige Signalübertragung und die IFN-Induktion unverändert. Biochemische Analysen haben gezeigt, dass die RIG-I/ MAVS-Signalübertragung für die TBK1-Aktivierung primär auf TANK, NAP1 und SINTBAD angewiesen ist, während die TLR3/ 4- und cGAS-STING-vermittelte TBK1-Aktivierung durch OPTN gesteuert wird. Dies etabliert ANKIB1 als zentralen Regulator der TBK1-Aktivierung in OPTN-abhängigen PRR-Signalwegen. In-vivo-Studien haben weiterhin gezeigt, dass ein Mangel an ANKIB1 die IFN-Produktion TLR3- nachgeschalteter Signalübertragung abschwächt, wodurch Interferonopathie gemildert sowie die Überlebensrate in einem sekundären hämophagozytischen Lymphohistiozytose (HLH)-Modell verbessert werden kann. Umgekehrt beeinträchtigt die Reduktion von ANKIB1 die Typ-I-IFN-Antworten und die antivirale Immunität, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für eine Infektion mit dem Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) führt, welches primär die cGAS-STING-Signalübertragung aktiviert. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine unerwartete und unverzichtbare Rolle der K11-verknüpften Ubiquitin-Signalgebung bei der PRR-vermittelten IFN-Produktion und den Immunantworten, sowohl in vitro als auch in vivo.
German
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Cinko, Muhammed Talha
muhammed.cinko@uk-koeln.de
https://orcid.org/0000-0001-8503-9120
UNSPECIFIED
URN: urn:nbn:de:hbz:38-815147
Identification Number: 10.1038/s41556-026-01886-z
Date: 2026
Publisher: Nature Cell Biology
Language: English
Faculty: Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions: Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects: Life sciences
Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:
Keywords
Language
Ubiquitination, E3 Ubiquitin Ligase, Interferon, Innate Immunity, Patter Recognition Receptors
English
UNSPECIFIED
English
Date of oral exam: 23 October 2026
Referee:
Name
Academic Title
Walczak, Henning
Pro. Dr.
Refereed: Yes
URI: http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/81514

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