Universität zu Köln

Mohn, Marie Agatha (2019). Plant nitrate reductase and its isoform specific roles in nitrate and nitrite reduction. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Viele Pflanzen, unter anderem Arabidopsis thaliana, exprimieren zwei Isoformen der Nitrat Reduktase (NR1 und NR2). Dieses Enzym katalysiert die Reduktion des Nitrats zu Nitrit, und damit die schrittlimitierende Reaktion in der Nitratassimilation. Zudem ist NR eine wichtige enzymatische Quelle des universellem Signalmoleküls NO•. NR bildet ein Dimer mit drei redox-Cofactoren je monomer; am N-Terminus, ein Molybdän-Cofactor (Moco), in der Mitte eine Häm-b5 und am C-Terminus ein FAD Cofactor. Elektronen werden übertragen vom zellulärem NADH, über FAD und Häm zu dem Substrat, das von Moco reduziert wird. Die Regulierung der NR Aktivität ist komplex und vielschichtig. Tagsüber wird die Transkription hochreguliert, angepasst an der photosynthetesischen Aktivität, nachts wird es herunterreguliert. Zudem wird NR über ein komplexes System der post-translationalen Regulation gesteuert in dem ein regulatorisches 14-3-3 Protein an einem phosphorylierten Serin-Rest bindet und Domän-Bewegungen und damit Aktivität verhindert. Diese Form der Regulierung ist schnell und reversible und verhindert ein toxischen Überschuss an Nitrit. Interessanterweise ist es in genau diesen Situationen in denen die Nitrit-Konzentration kurzfristig steigt, in welchen NO• Produktion beobachtet wird. Obwohl es bekannt ist, dass NR in der Pflanze eine wichtige Quelle für NO• ist, wurden die kinetischen Parameter der Nitritreduktion durch rekombinante NR noch nicht untersucht. Zudem wurde noch nicht untersucht ob die zwei (oder mehr) Isoformen der NR vielleicht unterschiedlich beteiligt sein könnten an den zwei Reaktionen die das Enzym katalysiert. In dieser Arbeit wurden die zwei Isoformen der NR rekombinant exprimiert und in verschiede kinetische Analysen verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass NR1 einen hohen KM für Nitrat besitzt und eine vielfach niedrigere katalytische Effizienz für das Substrat Nitrat, verglichen mit NR2. In der Nitritreduktion hat NR1 ein etwa 10-fach höherem kcat verglichen mit NR2. Zudem wurden Unterschiede zwischen den Isoformen in der 14-3-3 Regulation festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen dass NR1 ein spezializiertes Enzym der Nitrit-Reduktion ist, während NR2 eine Nitrat Reduktase ist. Zudem wurde mittels cryo-EM ein Model der NR generiert. Diese Methode könnte in Zukunft helfen die Molekularstruktur des NR’s zu ermitteln.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Many plants, including the model plant Arabidopsis thaliana, express two isoforms of the enzyme nitrate reductase (NR1 and NR2). This enzyme catalyses the first and rate-limiting step of nitrate assimilation by conversion of nitrate to nitrite. Furthermore, by reduction of nitrite to NO•, NR is also a major enzymatic source of this universally important signalling molecule in the plant. NR is a large, dimeric, multi-domain protein containing three redox-active cofactors per monomer – a Moco at the N-terminus, a b5-type heme located centrally, and an FAD cofactor at the C-terminus. NR transfers electrons from the cellular electron donor NADH through the FAD cofactor, then the heme, to the Moco where the substrates nitrate or nitrite bind and are reduced. Regulation of NR activity is complex and takes place on multiple levels. Transcriptional regulation mainly functions to serve the diurnal requirement for NR in the plant with up-regulation to match photosynthetic activity during daylight, and down-regulation at night. In addition, a complex post-translational regulation mechanism for NR is known in which a regulatory 14-3-3 protein binds to a phosphorylated serine and arrests domain movement and activity. This means of regulation is fast and reversible allowing the plant to respond within minutes to darkness or lack of CO2 and avoid long-term, toxic nitrite accumulation. On the other hand, there is evidence, that in situations in which a short-term spike in nitrite concentration is observed, NO• generation occurs. The kinetic parameters for nitrite reduction have never been determined before for pure recombinant NR protein. In addition, it has not been tested, whether the two or multiple isoforms of NR in many plant species may have distinct catalytic roles in the plant. To examine these questions, the two NR isoforms of Arabidopsis were separately expressed and compared in multiple kinetic studies. It could be shown that NR1 has a very large KM for nitrate and a far lower catalytic efficiency compared with NR2, while NR1 has a 10-fold higher kcat for nitrite and a five-fold higher catalytic efficiency compared with NR2. Additionally, differences were observed in the post-translational regulation of NR1 and NR2 via 14-3-3 proteins. These results show that NR2 is a dedicated nitrate reductase and NR1 a nitrite reductase. In addition, a model of the NR structure could be obtained by cryo-EM and this method offers a promising possibility to determine the molecular structure of NR in the future. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Mohn, Marie Agatha mariecormican@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-100235
Date:	March 2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Nitrate reductase English nitric oxide English nitrite English NO English enzyme kinetic English Moco UNSPECIFIED
Date of oral exam:	17 April 2019
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Guenter Prof. Dr. Kopriva, Stanislav Prof. Dr.
Funders:	SCHR1529/1-1
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/10023