Universität zu Köln

Mi, Weiqian (2003). Wallerian degeneration and Wallerian-related axon loss in disease. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Summary The slow Wallerian degeneration mouse, C57BL/WldS, carries a dominant mutation which delays Wallerian degeneration in the distal stump of an injured axons for several weeks in both central and peripheral nervous system (CNS and PNS). A highly unusual 85 kb tandem triplication was previously identified in the WldS mouse and during the period of my PhD work was shown to be the causative mutation, acting through a Ube4b/Nmnat chimeric gene contained within it. The aims of project described in this thesis were 1) to develop a suitable method to track the inheritance of the 85 kb tandem triplication WldS allele; 2) to investigate the instability of 85 kb triplication at the chromosomal level; 3) to explore whether WldS could alleviate or rescue axon loss in PNS and CNS neurodegenerative disease by crossing WldS with mouse models of neurological disorders; 4) to characterize WldS protein and 5) to investigate the possible mechanism involving in delaying Wallerian degeneration. Three genotyping methods for WldS were developed, namely PCR, Southern blotting and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) (Chapter 3). The relative merits of these three methods for genotyping of WldS are discussed: PFGE is the only qualitative method to distinguish homozygotes from heterozygotes, but usually needs to be done post-mortem; PCR is a quick assay, however it is difficult to distinguish homozygotes from heterozygotes, or wild-type from false negative; Southern blotting could resolve the false negative problem in PCR with a constant wild-type band as an internal control, but could only distinguish homozygotes from heterozygotes partially by the relative strength of WldS-specific band and the constant band. The PFGE method was used to look for any possible instability of the 85 kb tandem triplication in WldS at the chromosome level (Chapter 4). In total 180 chromosomes of WldS from three divergent breeding colonies at different ages have been examined and all found to carry the triplication. Thus, the triplication mutation is stable during both mitosis and meiosis. Such a study almost rules out instability as a source of phenotypic variation. It is essential to know this for accurate interpretation of studies the effect of WldS on neurodegenerative phenotypes (see Chapter 5). At the outset of this work, the effect of WldS on axon degeneration in disease, as opposed to injury, was completely unknown. I collaborated with the group of Rudolf Martini (University of Würzburg) in a study showing that WldS protects axons in a myelin-related peripheral neuropathy (the P0-/- mouse)(Chapter 3). Simultaneously, work in another collaborating group revealed a similar protective effect in progressive motor neuronopathy (pmn). To investigate whether WldS has effect on axonal loss in CNS neurological disorders, I crossed WldS with gad (gracile axonal dystrophy) mice (Chapter 5), a simple genetic mouse model (with a defect in Uchl1, ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1) of CNS neurodegenerative disease with a defect in ubiquitin system and axonal spheroid pathology in CNS. WldS significantly reduced axonal spheroid numbers and secondary pathology (myelin loss and astrocyte activation). However, neuromuscular synapse pathology still developed with age, leading probably to the complex behavioral changes observed. The observations that WldS can alleviate axonal spheroid pathology in gad mice in our study and also delay axon loss in PNS disorders with dying-back axon degeneration in our collaborators' studies, suggest that formation of distal axonal spheroids shares a regulatory step with Wallerian degeneration and 'dying-back' axon loss without spheroids, and that WldS delays a central step of such axon pathology. Ube4b/Nmnat (WldS) is known to delay Wallerian degeneration, however the protective mechanism is unknown. I also contributed to studies to characterize WldS and its role in delaying Wallerian degeneration. Firstly, I generated recombinant protein and polyclonal antiserum that were used to show that WldS protein is predominantly nuclear. Secondly, I generated transgenic mice carrying the N-terminal 70 amino acid (N70) of WldS fused with nuclear localization signal (NLS) or nuclear export signal (NES) to test whether the N70 was sufficient for the WldS phenotype and in which intracellular compartment it has to be located. The phenotype was analyzed by examining the preservation of neurofilament protein in lesioned nerves by western blotting or axonal integrity using a YFP marker protein. Transgenic N70-NLS or N70-NES heterozygotes / homozygotes did not show WldS phenotype, however there was not detectable N70-NLS or N70-NES protein expression level by western blotting. In conclusion, pulsed field gel electrophoresis (PFGE) is the only qualitative method to distinguish WldS homozygotes from heterozygotes comparing to the alternatives of PCR and Southern blotting. The WldS triplication is stable under normal conditions and is the predominant, and possibly exclusive, allele in the current WldS breeding colonies. WldS alleviates chromic PNS and CNS axon pathology in gad mice. Formation of distal axonal spheroids shares a regulatory step with Wallerian degeneration and 'dying-back' axon loss without spheroids. The N70-NLS or N70-NES experiments were inconclusive with the existing transgenic lines but WldS was shown to be a predominantly nuclear protein using the antiserum that I generated.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Wallerische degeneration und der damit verbundene Axonverlust in verschiedenen krankheiten German Wallerian degeneration and Wallerian-related axon loss in disease English
Translated abstract:	Abstract Language Zusammenfassung Die C57BL/WldS (langsame Waller'sche Degeneration) Maus, besitzt eine dominante Mutation, welche die Waller'sche Degeneration am distalen Ende eines verletzten Axons sowohl im zentralen (ZNS), als auch im peripheren Nervensystem (PNS) über mehrere Wochen hinauszögert. Eine äußerst ungewöhnliche 85 kb Tandem Triplikation wurde vorher in der WldS Maus identifiziert. Während meiner Dissertationsarbeit konnte gezeigt werden, daß diese Mutation über ein darin enthaltenes Ube4b/Nmnat chimeres Gen agiert. Die Ziele des Projektes dieser Dissertation sind: 1) Die Entwicklung einer geeigneten Methode zur Verfolgung der Herkunft des 85 kb Tandem Triplikation WldS Allels, 2) die Untersuchung der Stabilität der 85 kb Triplikation auf chromosomaler Ebene; 3) die Erkundung ob WldS den Axonenverlust bei neurodegenerativen Krankheiten im PNS und ZNS durch Kreuzung mit deren Mausmodellen abmildern oder verhindern kann; 4) die Charakterisierung des WldS Proteins und 5) die Untersuchung von möglichen Mechanismen, welche die Waller'sche Degeneration verzögern. Drei Methoden zur Genotypenbestimmung von WldS wurden entwickelt: PCR, Southern Blotting und Pulsed-Field Gel Electrophorese (PFGE) (Kapitel 3). Die relativen Vorteile dieser drei Methoden zur Genotypisierung von WldS werden im folgenden diskutiert: PFGE ist die einzige qualitative Methode um Homozygoten von Heterozygoten zu unterscheiden, muß aber post-mortem durchgeführt werden; PCR ist eine rapide Methode, bei der es aber schwierig ist, Homozygoten von Heterozygoten, oder Wildtypen von Falsch-Negativen zu unterscheiden; Southern Blotting würde das Problem der Falsch-Negativen im PCR mithilfe einer konstanten Wildtyp-Bande als Standard lösen, erlaubt aber die Unterscheidung von Homozygoten von Heterozygoten nur über einen Vergleich der relativen Bandintensitäten der WldS mit der Standardbande. Die PFGE Methode wurde verwendet, um eventuelle Instabilitaeten der 85 kb Triplikation in WldS auf chromosomaler Ebene zu untersuchen (Kapitel 4). Es wurden insgesamt 180 Chromosomen von WldS aus drei divergenten Kolonien und bei verschiedenen Altersabschnitten untersucht, und alle enthielten die Triplikation. Dies zeigt die Stabilität der Triplikation während der Mitose als auch der Meiose. Diese Untersuchung diente vor allem dazu, Chromosomeninstabilität als Quelle von phänotypischer Variation auszuschließen. Für die genaue Auswertung der Untersuchungen der Wirkung von WldS auf neurodegenerative Phänotypen (siehe Kapitel 5) war diese Feststellung essentiell. Im Gegensatz zu den Effekten von WldS auf Läsionen waren zu Beginn dieser Arbeit die Effekte von WldS auf axonal degenerative Krankheiten noch völlig unbekannt. In Kollaboration mit der Gruppe von Rudolf Martini (Universität Würzburg) arbeitete ich an einer Studie, die zeigte, daß WldS Axone in einer Maus mit einer Myelin Neuropathie im PNS (P0-/- Maus) schützt (Kapitel 3). Gleichzeitig konnte in Zusammenarbeit mit einer anderen Gruppe ein ähnlicher Schutzeffekt bei der Progressiven Motorneuropathie (pmn) gezeigt werden. Um zu untersuchen, ob WldS eine Wirkung auf den Axonenverlust in neurologischen Krankheiten des ZNS hat, kreutzte ich WldS mit gad (gracile axonal dystrophy) Mäusen (Kapitel 5). gad ist ein einfaches genetisches Mausmodell (Defekt in Uchl1, der Ubiquitin carboxyterminalen Hydrolase l1) einer zentral neurodegenerativen Krankheit mit einem Defekt im Ubiquitin System und axonaler Spheriod Pathologie. WldS konnte im signifikanten Maße die Anzahl der Spheroide und sekundäre pathologische Symptome wie Myelinverlust und Astrozytenaktivation reduzieren. Pathologische Symptome der Muskelsynapsen entwickelte sich dennoch mit wachsendem Alter, wodurch vermutlich die Entwicklung komplexer Verhaltensänderungen herbeigeführt wurde. Sowohl die Beobachtungen in unseren Studien, daß WldS die Pathologie der axonalen Spheroide in gad Mäusen abmildert, als auch die Beobachtungen der kollaborierenden Gruppe, daß WldS die Axonverluste in PNS Krankheiten mit Rückdegeneration verzögert , läßt vermuten, daß die Formation eines Spheroids im distalen Axon bei einem regulatorischen Schritt stattfindet, und zwar sowohl bei der Wallerdegeneration und als auch bei rückdegenerierenden Axonverlusten ohne Spheroidformation. WldS verzögert daher einen zentralen Schritt in der Pathologie von Axonen. Es ist bekannt, daß Ube4b/Nmnat (WldS) die Wallerdegeneration verzögert, jedoch ist der protektive Mechanismus unbekannt. Ich habe daher Untersuchungen durchgeführt, die zur Charakterisierung von WldS führten, und dessen Rolle in der Verzögerung der Waller Degeneration darstellten. Zunächst generierte ich ein rekombinantes Protein und ein polyklonales Antiserum, mit deren Hilfe es ist gezeigt worden, daß das WldS Protein sich überwiegend im Nukleus befindet. Zweitens produzierte ich eine transgene Maus, welche die N-terminalen 70 Aminosäuren (N70) von WldS in Fusion mit einem Nuklearen Lokalisations Signal (NLS) bzw. Nuclear Export Signal (NES) enthielt. Diese dienten dazu zu testen, ob N70 allein genügte, um den WldS Phänotyp hervorzurufen, und in welchem Zellkompartiment das Protein lokalisiert war. Der Phänotyp wurde anhand der Erhaltung von Neurofilament Proteinen in den verletzten Nerven untersucht. Die Experimente liefen über Western Blot bzw. über Untersuchungen der Axonenintergrität unter Verwendung eines YFP Marker Proteins. Transgene N70-NLS oder N70-NES Heterozygoen bzw. Homozygoten zeigten keinen WldS Phänotyp, wobei aber auch keine N70-NLS oder N70-NES Proteine im Western Blot detektiert wurden. Im Vergleich zu den Methoden PCR und Southern Blotting war PFGE letztendlich die einzige qualitative Methode um WldS Homozygoten von Heterozygoten zu unterscheiden. Die WldS Triplikation ist unter Normalbedingungen stabil und ist das prädominierende und möglicherweise einzige Allel in den gegenwärtigen WldS Züchtungen. WldS mildert chronische pathologische Sympome in PNS und ZNS Axonen von gad Mäusen. Die Formation eines distalen axonalen Spheroids repräsentiert einen Regulationsschritt bei der Wallerdegeneration und bei rückwärtigen Axonenverlusten ohne Spheroide. Die N70-NLS und N70-NES Experimente waren bei den vorhandenen transgenen Kolonien nicht eindeutig, aber unter dem von mir hergestellten Antiserum konnte gezeigt werden, daß WldS ein vorüberwiegend nuklear lokalisiertes Protein ist. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Mi, Weiqian aek74@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-10223
Date:	2003
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Wallerische degeneration, Axonverlust German Wallerian degeneration, axon loss English
Date of oral exam:	6 November 2003
Referee:	Name Academic Title Prof. Dr. Sigrun Korsching, UNSPECIFIED
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1022