Universität zu Köln

Bartusel, Michaela (2019). Disruption of neural crest enhancer landscapes as an etiological mechanism for human neurocristopathies. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The embryonic development of the human facial features is a highly complex mechanism which requires very exact spatial and temporal regulation of gene expression during neural crest (NC) development. NC cells (NCC) are a transient embryonic cell type with wide differentiation potential that contributes to the formation and morphogenesis of multiple tissues and organs, including many parts of the face. Just like any other cell type, NCC possess a characteristic set of enhancers that, by controlling the expression of specific genes, define cellular identity. Impairment of this regulation can lead to craniofacial malformations, such as orofacial cleft (OFC), which are frequently referred to as neurocristopathies and that represent a heavy burden on both the affected individuals and society. Understanding how genetic or structural disruption of enhancer activity during NC development can lead to human neurocristopathies is the central goal of this work. In the long term, the gained knowledge should serve to enable early detection and show potential therapeutic approaches. Here we investigate the pathomechanism of both syndromic (i.e. Branchiooculofacial Syndrome (BOFS)) and non-syndromic (i.e. OFC) neurocristopathies, by combining in vitro and in vivo NC developmental models with genetic engineering approaches and multiple genomic methods. First, we describe a unique patient with BOFS, who, in contrast to previously reported cases, does not present a heterozygous mutations within TFAP2A, a NC master regulator. Instead, the patient carries a de novo heterozygous 89 Mb inversion in which one of the breakpoints is located 40 kb downstream of TFAP2A. We first showed that this inversion separates TFAP2A from enhancers that are located within the same large topologically associating domain (TAD) and that are essential for TFAP2A expression in NCC. Importantly, using patient-specific human induced pluripotent stem cells (hiPSC) and a robust in vitro differentiation system towards NCC, we then showed that the inversion causes a loss of physical interactions between the inverted TFAP2A allele and its cognate enhancers, leading to TFAP2A monoallelic and haploinsufficient expression in human NCC. Overall, this first part provides a powerful approach to investigate the pathological mechanisms of structural variants predicted to disrupt 3D genome organization of gene regulatory landscapes and that, due to various reasons (i.e. limited access to relevant patient material, differences in gene dosage sensitivity between mice and humans, difficulties in recapitulating certain structural variants), cannot be properly evaluated in vivo. Second, we combined previously generated hNCC enhancer maps with OFC risk-loci identified through genome-wide association studies (GWAS) and, as a result, we revealed a highly conserved enhancer (i.e. Enh2p24.2) as a potential candidate harboring genetic variants involved in OFC. GWAS link common single nucleotide polymorphisms (SNPs) with quantitative traits and complex disorders. However, most disease-associated SNPs occur in non-coding regions of the human genome and consequently, the etiological relevance of these genetic variants cannot be easily connected to a gene. Nevertheless, accumulating evidences suggest that these disease-associated SNPs may contribute to human disease susceptibility by altering enhancers. Interestingly, SNPs associated with OFC are overrepresented in NCC enhancers. Therefore, we hypothesize that SNPs associated with OFC contribute to the etiology of the disorder by altering NCC enhancers and, consequently, the expression of relevant genes. Using Enh2p24.2 as a bait in circularized chromosome conformation capture sequencing (4C-seq) experiments, we identified two distally located genes, MYCN and DDX1, as its potential targets. Using in vitro and in vivo NCC developmental models, we then demonstrated that both genes are essential for normal facial development. While MYCN was not a surprising candidate to be involved in the etiology of OFC, the identification of DDX1 as a novel regulator of facial development might provide new insights into the molecular processes (e.g. transcription-coupled DNA repair) implicated in OFC and, potentially, other human neurocristopathies (e.g. neuroblastoma).

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Störung von Neuralleisten-Enhancer-Landschaften als ätiologischer Mechanismus für humane Neurocristopathien German
Translated abstract:	Abstract Language Die embryonale Entwicklung der menschlichen Gesichtszüge ist ein hochkomplexer Mechanismus, der eine sehr genaue räumliche und zeitliche Regulierung der Genexpression während der Entwicklung der Neuralleiste (NL) erfordert. Neuralleistenzellen (NLZ) sind ein transienter embryonaler Zelltyp mit breitem Differenzierungspotential, der zur Bildung und Morphogenese mehrerer Gewebe, einschließlich großer Teile des Gesichts, beiträgt. Wie jeder andere Zelltyp besitzen NLZ einen charakteristischen Satz von Enhancern, die durch Steuerung der Expression spezifischer Gene die zelluläre Identität definieren. Eine Beeinträchtigung dieser Regulation kann zu Missbildungen, z. B. einer Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalte (LKGS), führen, die häufig als Neurokristopathien bezeichnet werden und sowohl für die Betroffenen als auch für die Gesellschaft eine schwere Belastung darstellen. Das zentrale Ziel dieser Arbeit ist es, zu verstehen, wie genetische oder strukturelle Störungen der Enhancer-Aktivität während der NL-Entwicklung zu humanen Neurokristopathien führen können. Das gewonnene Wissen soll langfristig dazu dienen, eine frühzeitige Erkennung zu gewährleisten und mögliche therapeutische Ansätze aufzuzeigen. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir den Pathomechanismus sowohl einer syndromischen (hier: Branchiookulofaziales Syndrom (BOFS)) als auch einer nicht-syndromischen (hier: LKGS) Neurokristopathie untersucht, indem wir in vitro und in vivo Entwicklungsmodelle mit gentechnischen Ansätzen und mehreren genomischen Methoden kombinierten. Zunächst beschreiben wir einen Patienten mit BOFS, der im Gegensatz zu bekannten Fällen keine Mutationen innerhalb von TFAP2A, einem NL-Master-Regulator, aufweist. Stattdessen trägt der Patient eine de novo heterozygote Inversion, bei der eine der Bruchstellen 40 kb von TFAP2A entfernt liegt. Unter Verwendung patientenspezifischer humaninduzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC) und eines in vitro Differenzierungssystems in NLZ konnten wir zeigen, dass die Inversion zu einem Verlust der physischen Interaktion zwischen dem invertierten TFAP2A-Allel und seinen zugehörigen Enhancern führt. Dies wiederum führt zu monoallelischer und unzureichender TFAP2A-Expression in menschlichen NLZ. Insgesamt bietet dieser erste Teil einen aussagekräftigen Ansatz, um die pathologischen Mechanismen von Strukturvarianten zu untersuchen, die die 3D-Genomorganisation stören können, die aber aus verschiedenen Gründen (z. B. eingeschränkter Zugang zu relevantem Patientenmaterial, Unterschiede in der Gendosisempfindlichkeit zwischen Mäusen und Menschen, Schwierigkeiten bei der Rekapitulation bestimmter Strukturvarianten) in vivo nicht richtig bewertet werden können. Zweitens haben wir zuvor generierte NLZ-Enhancer-Karten mit LKGS-Risikostellen kombiniert, die durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) identifiziert wurden. Dadurch konnten wir einen hochkonservierten Enhancer (Enh2p24.2) als potenziellen Kandidaten für genetische Varianten ausmachen, die zur Entwicklung von LKGS beitragen. GWAS verbinden genetische Polymorphismen mit quantitativen Merkmalen und komplexen Störungen. Die meisten krankheitsassoziierten Polymorphismen treten jedoch in nicht-kodierenden Regionen des menschlichen Genoms auf, weshalb die ursächliche Relevanz dieser genetischen Varianten nicht einfach mit einem Gen in Verbindung gebracht werden kann. Interessanterweise treten Polymorphismen, die mit einer LKGS assoziiert sind, überdurchschnittlich häufig in NLZ-Enhancern auf. Daher nehmen wir an, dass diese Polymorphismen zur Ursache der Störung beitragen, indem sie NLZ-Enhancer und folglich die Expression relevanter Gene verändern. Unter Verwendung von Enh2p24.2 als Ausgangspunkt für 4C-seq Experimente konnten wir zwei Gene, MYCN und DDX1, als potenzielle Ziele des Enhancers identifizieren. Mithilfe von in vitro und in vivo NLZ-Entwicklungsmodellen konnten wir außerdem zeigen, dass beide Gene für eine normale Gesichtsentwicklung unerlässlich sind. Während MYCN kein überraschender Kandidat für die Entwicklung von LKGS war, könnte die Identifizierung von DDX1 als neuer Regulator der Gesichtsentwicklung neue Einblicke in die molekularen Prozesse (z. B. die transkriptionsgekoppelte DNS Reparatur) liefern, die mit LKGS und möglicherweise anderen humanen Neurokristopathien (z. B. Neuroblastom) zusammenhängen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bartusel, Michaela michaela.bartusel@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-104612
Date:	December 2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language neural crest UNSPECIFIED enhancer UNSPECIFIED TFAP2A UNSPECIFIED
Date of oral exam:	6 December 2019
Referee:	Name Academic Title Wirth, Brunhilde Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/10461