Immunomics: Entwicklung einer ESI-MS basierten Methodik zur Differenzierung und Quantifizierung von humanen Immunglobulinen und ihrer Glykosylierung

Martens, Lejon (2003). Immunomics: Entwicklung einer ESI-MS basierten Methodik zur Differenzierung und Quantifizierung von humanen Immunglobulinen und ihrer Glykosylierung. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Dissertation_Lejon_Martens2.pdf
Download (3MB)

Abstract

Immunglobulin G (IgG) ist ein Glykoprotein, das von B-Zellen produziert wird, und ausserdem ein Hauptakteur der humoralen Immunantwort. Das IgG ist essentiell fuer die Verteidigung gegen bakterielle und virale Infektionen. Es existieren vier IgG-Subklassen, die urspruenglich durch die einzigartige Antigenizitaet ihrer schweren Ketten im konstanten Bereich definiert wurden. Waehrend die IgG-Subklassen eine Sequenzidentitaet von mehr als 93 % besitzen, existieren eine Vielzahl verschiedener allotypischer Varianten fuer jede der vier IgG-Subklassen. Die einzelnen Subklassen besitzen dabei einzigartige Effektorfunktionen, die auch durch die Glykosylierung beeinflusst werden. Jede IgG-Subklasse kann dabei eine spezifische Immunantwort gegen ein Antigen dominieren und einige Krankheiten sind demnach mit abnormen IgG-Subklassenkonzentrationen aber auch mit charakteristischen Glykosylierungsprofilen verbunden. Dieses wurde auch fuer die IgG-Allotypen gezeigt. In diesem Zusammenhang wurde eine umfassende Methodik zur Differenzierung und Quantifizierung von humanen Immunglobulinen G (IgG) entwickelt. Waehrend sich der erste Teil der Arbeit auf Variationen der Aminosaeuresequenz konzentriert, befasst sich der zweite Teil mit der konservierten N-Glykosylierung im konstanten Bereich der Immunglobuline. Teil I - Sequenzvariabilitaet von IgG. Es wurde eine allgemein anwendbare, schnelle Methode zur Erstellung eines IgG-Profils von humanen kaukasischen Individuen entwickelt. Dies beinhaltet die qualitative Detektion vorhandener IgG-Allotypen und die Quantifizierung der vier IgG-Subklassen. Dazu wurden spezifische Markerpeptide fuer einzelne IgG-Subklassen und Allotypen, die bei einem proteolytischen Totalverdau von Human-Plasma entstehen, theoretisch vorhergesagt und anschliessend mittels Flussigkeitschromatographie-(LC)/Elektrospray-Ionisation-(ESI)-Tandemmassenspektrometrie-(MS/MS) detektiert und quantifiziert. Die Strategie ist auf andere Immunglobuline uebertragbar. Durch Vergleich der IgG-Profile verschiedener intravenoeser IgG (IVIG)-Praeparationen mit europaeischem und amerikanischem Poolplasma konnte nachgewiesen werden, dass die Allotypenverteilung der IgG bei der Produktion nicht veraendert wird, sondern mit dem, beim Herstellungsprozess verwendeten, Human-Plasma uebereinstimmt. Der Vergleich der IgG-Profile von kaukasischen Individuen zeigte zudem, dass der Anteil zweier Allotypen einer IgG-Subklasse bei heterozygoten Individuen variiert, was ein Beleg fuer die unterschiedliche Aktivitaet der fuer die IgG-kodierenden Genloci ist. Teil II - Glykosylierung von IgG. Es wurde eine Methode zur Erstellung eines Glykosylierungsprofils von IgG bis hin zur Charakterisierung der Oligosaccharidpaarung im Fc(gamma)1-Fragment entwickelt. Dazu wurden die Glykopeptide proteolytisch verdauter IgG-Fraktionen mittels LC/ESI-MS quantifiziert. Die Quantifizierung umfasst, neben den Hauptkomponenten, die sich von den fukosylierten zweiantennigen Oligosaccharidstrukturen ableiten, auch die defukosylierten und biverzeigenden Komponenten. Ein Vergleich der Glykosylierungsprofile von humanen Individuen ergab einen, um eine Groessenordnung variierenden Fukosylierungsgrad, wogegen sich der Anteil der uebrigen Glykospezies kaum aenderte. Da eine 50-fach gesteigerte antikoerperabhaengige zellulaere Zytotoxizitaet (ADCC) durch einen hoeheren Anteil defukosylierter Glykospezies in Hybridoma-Zellkulturen bereits nachgewiesen wurde, koennte die beobachtete Schwankung beim Menschen somit die Effektivitaet der ADCC beeinflussen. Die Paarung der Oligosaccharide im intakten Immunglobulin kann sowohl eine kooperative als auch additive Wirkung besitzen, was zu veraenderten Effektorfunktionen einzelner symmetrischer oder asymmetrischer Glykospezies fuehren kann. Durch Etablierung einer wissensbasierten Dekonvolution von ESI-MS-Daten intakter Fc(gamma)-Fragmente konnte erstmals die Paarung von Oligosacchariden mit biverzweigendem N-Acetylglucosamin verfolgt werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Immunomics: Quantification of human immunoglublines and their glycosylation by mass spectrometry	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Immunoglobulin G (IgG) is a glycoprotein produced by B cells and a major actor of the humoral immune response, essential in the defence against bacterial and viral infections. IgG divides into four subclasses and is originally defined by the antigenic uniqueness of the constant part of its heavy chains. The sequence identities between IgG subclasses reach up to 93 % and several allotypic variants are found for each of them. Every IgG sublass exhibits a unique profile of effector functions, which is influenced by its glycosylation profile. A given IgG subclass may predominate within a specific antibody response to a particular antigen and several disease states are also connected with abnormal Ig subclass levels or glycosylation patterns. This is also a matter of fact for the different IgG allotypes. In this context a comprehensive strategy has been developed to differentiate and quantify human immunoglobulines G (IgGs). While the first part of the work concentrates on variations of the amino acid sequence, the second part deals with the conserved N-glycosylation within the constant part of the immunoglobulines. Part I - Sequence variations of IgG. A generally applicable and rapid method for profiling of human IgG from caucasian individuals has been developed, including qualitative detection of IgG allotypes and quantification of the four IgG subclasses. Therefore, specific peptide markers for IgG subclasses and allotypes emerging from a proteolytic digest of human plasma were in silico predicted by using a self-developed program for subsequent detection and quantitation by liquid chromatography (LC)/electrospray ionization (ESI)-tandem mass spectrometry (MS/MS). The strategy is generally applicable and can therefore be applied to other immunoglobuline classes. A comparison of IgG profiles from different intravenous IgG (IVIG) preparations with european and american pool plasma showed that the allotypic distribution of IgG is not modified during production, but corresponds to the allelic distribution in human plasma used as starting material. Furthermore, a comparison of IgG profiles from heterozygote caucasian individuals revealed varying portions of allotypes belonging to one IgG subclass, indicating a variable activity of genloci encoding the different IgG allotypes. Part II - Glycosylation of IgG. A method for profiling the glycosylation of IgG up to the characterization of the oligosaccharide pairing in the intact Fc(gamma)1-fragments was developed. Therefore glycopeptides of proteolytically digested IgG were quantified by LC/ESI-MS. Apart from the variabel core fucosylated main components, the glycosylation profile includes also defucosylated oligosaccharides and structures with bisecting N-acetylglucosamine. A comparison of the glycosylation profile of human individuals revealed a varying degree of fucosylation in the order of magnitude, where the portion of other glycospecies remains fairly constant. Since a 50-fold increase in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) was obtained by the use of hybridoma cell lines with a higher portion of defucosylated glycospecies, the observed variation could also affect the effectiveness of ADCC in humans. The pairing of oligosaccharides in intact immunoglobulines can lead to both a cooperative and additive effect by changed effectorfunctions of individual symmetrical or asymmetrical glycospecies. By establishing a knowledge-based deconvolution of ESI-MS-data from intact Fc(gamma)-fragments pairing of the bisecting oligosaccharides could be monitored for the first time.

English

Creators: