Molecular taxonomy. Bioinformatics and practical evaluation - Kölner UniversitätsPublikationsServer

Pozhitkov, Alexander (2003). Molecular taxonomy. Bioinformatics and practical evaluation. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Summary Molecular taxonomy is a field that studies the diversity of organisms based on molecular markers. This work is devoted to develop a methodology of molecular taxonomy of small organisms. The ribosomal RNA (rRNA) is used as a molecular marker since its nucleotide sequence includes stretches of various levels of conservation, which can be used as species, genus and taxa specific regions. The organisms live in complex communities. To discover the composition of these communities, a hybridization assay employing oligonucleotide microarrays is developed to indicate the presence of a certain rRNA, in a sample under investigation. An additional method based on the pyrosequencing process is proposed here. In this case the mixture of rRNA genes is directly sequenced and the proportion of individual sequences is then calculated from the obtained pyrogram. The work comprises two parts: theoretical bioinformatics and practical evaluation. The first part tackles the problem of DNA-RNA duplex stability prediction. As a result, an ad hoc stability function is proposed. An algorithm and a program are developed for the design of oligonucleotides employed in the microarray approach. The kinetics of DNA-RNA duplex dissociation is considered as well. In addition, the formalism of the pyrosequencing approach is elaborated theoretically. The experimental part deals with the issues of oligonucleotide microarray establishment, including fabrication, immobilization, hybridization and scanning. A real-time kinetic setup for observing the RNA-DNA duplex dissociation was developed. The theoretical findings and quality of the oligonucleotide design are practically evaluated. The theory is found to be in a good accordance with experiment. The pyrosequencing approach is tested as well and is demonstrated to have enough power to discover the composition of a complex mixture of rRNA genes.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Zusammenfassung Mit Hilfe der molekularen Taxonomie wird die biologische Diversität von Organismen anhand von molekularen Markern untersucht. In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt, um kleine Organismen durch molekulare Taxonomie zu charakterisieren. Da die Nukleotidsequenzen Ribosomaler RNA (rRNA) Regionen aufweist, die verschiedene Ebenen der Konservierung haben, können sie als Art-, Genus- oder Taxonspezifische molekulare Marker dienen. Die Organismen leben in komplexen Ökosystemen. Um die Artenzusammensetzung dieser Ökosysteme zu untersuchen, wurde ein Hybridisierungsansatz mit Oligonucleotid Microarrays entwickelt um das Vorhandensein einer bestimmten rRNA aufzuzeigen. Zusätzlich wird hier ein zweiter Ansatz auf der Basis der Pyrosequenzierungtechnologie vorgestellt. In diesem Fall wird eine Mischung von rRNA Molekülen direkt sequenziert und der Anteil der einzelnen Arten wird dann von dem erhaltenen Pyrogram errechnet. Diese Arbeit lässt sich in zwei Teile geliedern: theoretische Bioinformatik und experimentelle Ansätze. Der erste Teil befasst sich damit, die Stabilität der DNA/RNA Duplexe vorherzusagen. Als Ergebnis wird eine ad hoc Stabilitätsformel vorgestellt. Ein Algorithmus und ein Program wurden entwickelt, um Oligonucleotide für den microarray Ansatz zu entwerfen. Ausserdem wurden die kinetischen Aspekte der Dissasoziation der DNA/RNA Duplexe berücksichtigt. Zusätzlich wurde der Formalismus des Pyrosequenzierungs Ansatzes theoretisch bearbeitet. Die experimentelle Teil befasst sich mit den Einzelheiten der Oligonucleotid Microarray Technologie, unter anderem mit der Herstellung der Arrays, Immobilisierung, Hybridisierung und mit dem Scannen. Ein "real-time" kinetischer Aufbau für die Beobachtung der DNA/RNA Duplex Dissasoziationen wurde entwickelt. Die theoretischen Ergebnisse und die Qualität des Oligonucleotiddesigns wurden praktisch ausgewertet, und es wurde festgestellt, dass die Theorie den experimentellen Ergebissen gut entsprach. Der Pyrosequenzierungsansatz wurde auch getestet und es wurde gezeigt, dass angewandt werden kann um die Zusammensetzung einer komplexen Mischung von rRNA Genen festzustellen.

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