Identifizierung von direkten Zielgenen des homöotischen Transkriptionsfaktors DEFICIENS aus Antirrhinum majus mittels Chromatin Immunopräzipitation

Müller, Bettina M. (2003). Identifizierung von direkten Zielgenen des homöotischen Transkriptionsfaktors DEFICIENS aus Antirrhinum majus mittels Chromatin Immunopräzipitation. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die Blüten angiospermer Pflanzen bestehen aus morphologisch distinkten Organen, die in vier Wirteln angeordnet sind. Im ersten Wirtel werden Sepalen, im zweiten Petalen, im dritten Stamina und im vierten Karpelle angelegt. In Antirrhinum üben die MADS-Box Transkriptionsfaktoren DEFICIENS (DEF) und GLOBOSA (GLO) Schlüsselfunktionen bei der Ausprägung der Petalen und Stamina aus. Der Funktionsverlust von DEF oder GLO resultiert in einer homöotischen Umformung von Petalen zu Sepalen und von Stamina in karpelloide Strukturen. Obwohl die Funktion von DEF bereits seit langem intensiv untersucht wird, ist bislang wenig über die von DEF in vivo gebundenen regulatorischen DNA-Bereiche der Zielgene bekannt. Um diese Zielsequenzen zu identifizieren, wurde die X-ChIP Technik in Antirrhinum etabliert. Diese Technik ermöglichte den Nachweis von DEF und GLO Proteinen an ihren in vivo DNA-Bindungsstellen. Hierbei wurden Proteine durch eine chemische Reaktion mit Formaldehyd in vivo kovalent mit den assoziierten DNA-Sequenzen verbunden. Das fixierte Chromatin wurde mittels Ultraschallwellen in kürzere Fragmente gespalten und Protein-DNA Komplexe wurden mit einem anti-DEF oder anti-GLO Serum immunopräzipitiert. Die durch Formaldehyd induzierten Quervernetzungen wurden gelöst und die immunopräzipitierten DNA-Fragmente analysiert. Durch die Anwendung der Technik wurden verschiedene Zielsetzungen verfolgt. Die vermutete direkte autoregulatorische Kontrolle der späten GLO Expression durch die Bindung von DEF/GLO an bestimmte GLO Promotorregionen wurde in vivo mittels X-ChIP Analyse bewiesen. Definierte Promotorbereiche potentieller DEF Zielgene wurden auf eine in vivo Interaktion mit DEF/GLO untersucht. Durch diese Analysen wurde gezeigt, daß DEF durch die Bindung des DEFH125 Promotors einen unmittelbaren Einfluß auf späte Ereignisse in der Blütenorganogenese ausübt. Die Kombination von Expression Profiling Studien und X-ChIP Technik führte zur Identifizierung eines Extensin-ähnlichen direkten DEF Zielgens, dessen Expression von DEF positiv reguliert wird. Somit wirkt DEF unmittelbar auf strukturelle Aspekte der Blütenentwicklung. Die Anwendung der X-ChIP Technik zur Isolierung neuer DEF Zielsequenzen durch die Klonierung immunopräzipitierter DNA-Fragmente wird diskutiert.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Identification of direct target genes of the homeotic transcription factor DEFICIENS from Antirrhinum majus by chromatin immunoprecipitation	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Flowers of higher plants are typically organized in four whorls: sepals and petals in the two outer whorls form the perianth, which surrounds two whorls of reproductive organs, stamens and carpels. The development of morphologically complex structures like flowers requires an accurate temporal and spatial control of gene expression. In Antirrhinum, key regulators of petal and stamen organogenesis are the MADS-box transcription factors DEFICIENS (DEF) and GLOBOSA (GLO). Loss-of-function of either of these two genes results in a petal to sepal and stamen to carpel conversion indicating that DEF and GLO participate in the same regulatory pathway. Although DEF function has been intensively studied the target genes that are recognized and bound by DEF in vivo remained elusive. To shed light on the downstream pathway of DEF control the cross-linked chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) technique has been established. This technique allowed the detection of DEF and GLO DNA binding sites in vivo. In short, formaldehyde was used to induce the formation of covalent bonds between proteins and DNA. The chromatin was solubilized by sonication and protein/DNA complexes were immunoprecipitated with an anti-DEF or an anti-GLO serum, respectively. Finally, the cross-links were fully reversed and the immunoprecipitated DNA fragments were analyzed. This technique was applied to follow different aims. X-ChIP analyses showed that the assumed autoregulatory control of the upregulation and maintenance of GLO expression is indeed accomplished by a direct binding of DEF/GLO to distinct regions of the GLO promotor in vivo. Putative DEF target genes that were previously isolated by different means were analyzed by X-ChIP experiments for a direct interaction with DEF/GLO. It was shown that DEF affects late developmental processes by regulating the expression of DEFH125, a MADS-box transcription factor that is most likely involved in microsporogenesis. The combination of expression profiling studies and chromatin immunoprecipitations identified an extensin-like gene as direct DEF target gene indicating that DEF controls structural aspects of flower development. The use of the X-ChIP technique to isolate novel DEF target genes by cloning immunoprecipitated DNA fragments is discussed.

English

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