Universität zu Köln

Kaspar, Sophie Melissa (2019). Disentangling the Role of CHOP in Mitochondrial Dysfunction. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Maintenance of mitochondrial homeostasis is essential for a broad spectrum of signalling, metabolic and energetic processes. Consequently, mitochondrial dysfunction is linked to the development of a wide range of myopathies and many common diseases, including type 2 diabetes, Parkinson's and Alzheimer's diseases. In response to disturbed mitochondrial proteostasis, an organelle-specific stress response is initiated, which results in an adaptive transcriptional response partially sharing the signature of the integrated stress response (ISR). However, the exact sequence of events of the signalling cascade resulting in the activation of a nuclear response remains elusive. CHOP was one of the first transcription factors (TFs) proposed to play a role in response to impaired mitochondrial proteostasis. Although - due to the lack of a functional DNA-binding domain - CHOP needs to form heterodimers with other TFs in order to activate or suppresses respective target genes. The present study aims to investigate the molecular aspects and in vivo functions of CHOP in a murine model of mitochondrial dysfunction. Therefore, DARS2/CHOP double-deficient mice, from now referred to as double knock-out (DKO) mice, were generated. Disruption of mitochondrial translation by heart and skeletal muscle-specific knock-out of the mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase Dars2 (DARS2 KO) results in severe mitochondrial dysfunction and causes the death of the animals with approximately seven weeks of age. Additional deletion of Chop even further reduces the lifespan to less than three weeks, suggesting an existential role of the TF within the initiated stress-signalling pathway. Our data indicate that CHOP's impact arises from the regulation of another TF: ATF4. The analysis of transcriptomic data uncovered excessive transcriptional activation of ATF4 targets in DKO mice. Those massive changes were further confirmed on the protein level and coincide with the rapid deterioration of the animal's health status. Co-immunoprecipitation experiments revealed the TF C/EBPβ as the most abundant CHOP interactor in hearts of DARS2 KO mice. Further experiments in cell culture showed that under normal conditions, mitochondrial dysfunction triggers CHOP and C/EBPβ protein expression. C/EBPβ has three isoforms: LAP*, LAP and LIP. In comparison to the isoforms LAP* and LAP, LIP exhibited a disproportionate increase under conditions of mitochondrial dysfunction. Our experiments confirmed opposite effects of LAP and LIP on Atf4 transcription. Whereas LAP promoted Atf4 transcription, LIP acted as a transcriptional repressor of Atf4. Notably, CHOP deficiency in the context of mitochondrial dysfunction resulted in an impaired response of LIP in particular, which failed to increase on the protein level as observed under wild type-like conditions. Hence we propose, that the impairment of LIP accumulation upon mitochondrial dysfunction in a CHOP-deficient background results in loss of negative regulation of Atf4 transcription in DKO animals. As a result, ATF4 is exceedingly active and causes an anabolic overstress of the mice. We propose to complement the current ISR model by a supplementary CHOP and LIP-driven regulatory layer, contributing to the transcriptional control of Atf4 in the context of mitochondrial dysfunction.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Zahlreiche zelluläre Kommunikations-, Stoffwechsel- und Energiebereitstellungs-Prozesse sind stark von der Aufrechterhaltung der mitochondriellen Homöostase abhängig. Folglich sind mitochondrielle Dysfunktionen eng mit einem weiten Spektrum an Erkrankungen, unter anderem vielen Myopathien aber auch allgemeineren Krankheiten (z.B. Typ 2 Diabetes, Parkinson und Alzheimer), verknüpft. Die Störung der mitochondriellen Proteostase induziert eine Organellen-spezifische Stressantwort. Es folgt die Aktivierung einer adaptiven, transkriptionellen Antwort, welche über eine große Schnittmenge mit der sogenannten Integrierten Stressantwort (ISA) verfügt. Allerdings ist der genaue Ablauf der Signalkaskade, die in die Aktivierung der nuklearen Antwort mündet, nur ansatzweise bekannt. Einer der ersten Transkriptionsfaktoren (TF), welcher mit der nuklearen Antwort infolge von einer gestörten mitochondriellen Proteostase in Verbindung gebracht wurde, ist CHOP. Aufgrund einer defizitären DNA-Bindungsdomäne von CHOP ist zu beachten, dass dieser TF für die Repression bzw. Aktivierung von Ziel-Genen auf die Bildung von Heterodimeren angewiesen ist. Ziel der vorliegenden Studie ist die Untersuchung der molekularen Aspekte sowie in vivo Funktionen von CHOP in einem Mausmodell mit bestehender mitochondrieller Dysfunktion. Für diesen Zweck wurde eine DARS2/CHOP doppel-defizitäre Mauslinie generiert, welche nachfolgend als Doppel-Knockout (DKO)-Mauslinie bezeichnet wird. Die Herz- und Skelettmuskel-spezifische Deletion der mitochondriellen aspartyl-tRNA-Synthetase Dars2 (DARS2 KO) resultiert in einer schweren mitochondriellen Dysfunktion und führt im Alter von etwa sieben Wochen zum Tod der Mäuse. Eine zusätzliche Deletion von Chop führt zu einer weiteren Verkürzung der Lebenserwartung auf weniger als drei Wochen, was auf eine essenzielle Funktion von CHOP im Rahmen der induzierten Stressantwort hindeutet. Unseren Daten zufolge hat die Wirkung von CHOP ihren Ursprung in der Regulation eines weiteren TFs: ATF4. Die Auswertung der Transkriptom-Daten offenbarte eine exzessive, transkriptionelle Aktivierung von ATF4 Ziel-Genen in DKO-Mäusen. Diese massiven Veränderungen wurden ebenfalls auf Proteinebene bestätigt und gingen einher mit einer rapiden Verschlechterung des Allgemeinzustands der Tiere. Der TF C/EBPβ wurde mittels Co-Immunpräzipitation als der am häufigsten auftretende Interaktionspartner von CHOP in Herzen von DARS2 KO-Mäusen identifiziert. Weiterführende Versuche auf Zellkulturebene zeigten, dass unter normalen Umständen mitochondrielle Dysfunktion die Expression der Proteine CHOP und C/EBPβ induziert. C/EBPβ tritt in drei Isoformen auf: LAP*, LAP und LIP. Bei vorliegender mitochondrieller Dysfunktion wies LIP, im Gegensatz zu den beiden anderen Isoformen LAP* und LAP, einen überproportional starken Anstieg auf Proteinebene auf. Unsere Versuche bestätigten gegensätzliche Effekte von LAP und LIP auf die Atf4-Transkription. Während LAP sich positiv auf die Atf4-Transkription auswirkte, agierte LIP als trankriptioneller Atf4-Repressor. Bemerkenswerterweise resultierte die CHOP-Defizienz im Kontext mitochondrieller Dysfunktion in einer beeinträchtigten Antwort von LIP. Der auf Proteinebene beobachteter Anstieg des TFs LIP im Wildtyp versagte bei CHOP-Defizienz. Daraus leiten wir den Verlust der negativen Regulation der Atf4-Transkription aufgrund eines fehlenden Anstiegs von LIP auf Proteinebene bei Abwesenheit von CHOP als Ursache für den beobachteten Phänotyp in DKO-Tieren ab. Die resultierende übermäßige Aktivierung von ATF4 führt zu einer anabolischen Überlastung der Mäuse. Aufbauend darauf schlagen wir eine Erweiterung des gegenwärtigen Modells der ISA um eine zusätzliche CHOP- und LIP-gesteuerte regulatorische Ebene vor, welche zur transkriptionellen Kontrolle von Atf4 im Kontext mitochondrieller Dysfunktion beiträgt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kaspar, Sophie Melissa UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-107302
Date:	2019
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	CECAD - Cluster of Excellence Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language CHOP UNSPECIFIED Integrated stress response (ISR) English ATF4 UNSPECIFIED Mitochondrial dysfunction UNSPECIFIED
Date of oral exam:	13 February 2020
Referee:	Name Academic Title Trifunovic, Aleksandra Prof. Dr. Wiesner, Rudolf Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/10730