Universität zu Köln

Dönges, Catharina Maria (2004). Reinigung und Charakterisierung der Cyclodextrin Glycosyltransferase (CGTase) aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Cyclodextrine (CD) sind zyklische Oligosaccharide aus sechs bis acht Glucoseeinheiten (alpha,- beta- und gamma-CD), die durch Cyclodextrin Glycosyltransferasen (CGTasen) aus Stärke und anderen Polysacchariden synthetisiert werden. Zur Herstellung von Cyclodextrinen, die in ihrem Inneren Gastmoleküle komplexieren können und deshalb vielfältige industrielle Anwendung finden, werden thermostabile CGTasen benötigt. In diesem Zusammenhang wurde die CGTase aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii hergestellt und charakterisiert, sowie Versuche zu ihrer Stabilisierung mittels gerichteter Evolution unternommen. Das cgtase Gen wurde mittels PCR aus genomischer DNA isoliert und in Escherichia coli heterolog exprimiert. Die CGTase wurde anschließend aus dem löslichen Zellextrakt über verschiedene chromatographische Methoden bis zu einer Reinheit von etwa 95 % angereichert. Die Charakterisierung mittels hydrodynamischer und spektroskopischer Methoden zeigte, dass es sich um ein monomeres Protein mit definierten Sekundärstrukturelementen und einer nativen Tertiärstruktur handelt. Die Stabilität der CGTase wurde mittels differentieller scanning calorimetry und irreversibler thermischer Inaktivierung getestet. Dabei zeigte sich, dass das Enzym durch sein Substrat Stärke und Ca(2+)-Ionen extrinsisch stabilisiert wird. Eine genauere Analyse der Ergebnisse deutet darauf hin, dass die thermische Inaktivierung der CGTase auch ohne vorherige Denaturierung des Proteins erfolgen kann, weshalb als Ursache der Inaktivierung eine chemische Modifizierung des aktiven Zentrums plausibel erscheint. Steady-state enzymkinetische Messungen der katalytischen Aktivität bei unterschiedlichen Enzym- und Substratkonzentrationen, Temperaturen und pH-Werten ergaben, dass bei allen untersuchten Reaktionsbedingungen zunächst hauptsächlich alpha-CD gebildet wird. Nach längeren Inkubationszeiten finden sich dagegen vergleichbare Mengen an alpha- und beta-CD, jedoch stets deutlich weniger gamma-CD. Zur thermischen Stabilisierung der CGTase wurden durch Error Prone PCR zwei Genbanken erstellt, wobei jeweils eine mutagenisierte Hälfte des cgtase Gens mit einer unveränderten Hälfte fusioniert war. Die Genbanken wurden im Rahmen eines neu entwickelten Screeningverfahrens auf stabilisierte CGTasen durchsucht. Dabei wurden mehrere CGTase Varianten isoliert und gereinigt. Ihre Charakterisierung zeigte jedoch, dass sie - aus bisher unverstandenen Gründen - weniger stabil als die widltypische CGTase waren.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Purification and Characterisation of the Cyclodextrin Glycosyltransferase (CGTase) of the Thermoalcaliphilic Bacterium Anaerobranca Gottschalkii English
Translated abstract:	Abstract Language Cyclodextrins (CD) are cyclic oligosaccharides consisting of 6-8 glucose units (alpha-, beta- und gamma-CD), which are synthesized by glycosyl transferases from starch and other polysaccharides. For the production of cyclodextrins, which can complex guest molecules in their interior, thermostable CGTases are required. Along these lines, the CGTase from the thermoalkaliphile bacterium Anaerobranca gottschalkii was produced and characterised. Moreover, it was attempted to increase its stability by directed evolution. The cgtase gene was isolated from genomic DNA by PCR, and heterologously expressed in Escherichia coli. Using different chromatographic procedures, the CGTase was enriched from the soluble fraction of the cell extract to about 95 % purity. The characterisation by hydrodynamic and spectroscopic methods showed that the enzyme is a monomer with native secondary elements and a well defined tertiary structure. The stability of the CGTase was investigated by differential scanning calorimetry and irreversible thermal inactivation. It was shown that the enzyme is stabilized extrinsically by its substrate starch and Ca(2+)-ions. A closer analysis of the results suggests that the inactivation of the CGTase does not require the previous denaturation of the protein and, as a consequence, might be due to the chemical modification of the active site. Steady-state enzyme kinetic measurements of the catalytic activity at various enzyme and substrate concentrations, temperatures and pH values showed that alpha-CD is the main initial reaction product, independent of the applied conditions. After prolonged incubation, however, comparable amounts of alpha- and beta-CD are found, which are much larger than the produced amounts of gamma-CD. In order to thermally stabilise the CGTase, two gene banks were produced by error prone PCR. In each of the two banks, a mutagenised half of the cgtase gene was fused to a native half. The gene banks were searched for stabilised CGTases, using a newly established screening assay. Several CGTases were isolated and purified. Their characterisation showed, however, that all of them were less stable than wild type CGTase, for reasons unclear so far. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Dönges, Catharina Maria cjuerge@gmx.de; 0221-470-3207 UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-11020
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language CGTase , Cyclodextrine , Stabilisierung , Inaktivierung , DSC German CGTase , cyclodextrins , stabilisation , inactivation , DSC English
Date of oral exam:	19 January 2004
Referee:	Name Academic Title Sterner, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1102