Universität zu Köln

Schelhaas, Mario (2003). Untersuchungen zu Eintrittsmechanismen des Herpes simplex Virus Typ 1 in Epithelzellen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Primäre Eintrittspforte für die Herpes simplex Virus Typ1 (HSV-1) Infektion ist das Schleimhautepithel. Der zelluläre Eintrittsprozess von HSV-1 bedingt eine Interaktion verschiedener viraler Glykoproteine mit unterschiedlichen Zelloberflächen-Rezeptoren, die gefolgt ist von der Penetration der Plasmamembran und dem Transport zum Zellkern. Das zentrale Interesse der vorliegende Arbeit bestand darin, zum Verständnis des viralen Eintritts in vivo beizutragen. Der HSV-1 Eintritt in individuelle Zellen wurde durch Immunfärbung gegen ICP0, einem Produkt sehr früher viraler Genexpression, sichtbar gemacht. Infektionsstudien in der epithelialen MDCKII Zellinie und in primären Keratinozyten deuten auf einen polaren Eintritt von HSV-1 unter Nutzung basolateraler Membrandomänen hin. Wenn humane Vorhautepidermis infiziert wurde, wurde HSV-1 Eintritt ausschließlich über basale Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass effizienter viraler Eintritt den Zugang zu basolateralen Membrandomänen bedingt. Zur weiteren Charakterisierung der HSV-1 Eintrittsmechanismen in Epithelzellen wurden potentielle molekulare Determinanten untersucht. Immunfärbung gegen den potentiellen Ko-Rezepor Nectin-1 zeigte keine Korrelation der Rezeptor-Lokalisierung und den Virus-Eintrittsstellen in Keratinozyten-Kulturen. Die Beteiligung des HSV-1 Glykoproteins D am Viruseintritt wurde durch Blockierungsexperimente bestätigt. Erste pharmakologische Inhibierungsexperimente in MDCKII Zellen ergaben keine Hinweise auf endozytotische Aufnahme verbunden mit pH-abhängiger Membranfusion von HSV-1. Da infizierte MDCKII Zellen und Keratinozyten Eigenschaften von migrierenden Zellen zeigten, könnten Prozesse der Zellmigration viralen Eintritt fördern. Die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts während der Zellmigration wird durch die Rhoähnlichen GTPasen Cdc42, Rac1 und RhoA kontrolliert. Nach transienter Expression dominanter GTPase Isoformen in MDCKII Zellen wurde eine signifikante Reduktion der HSV-1 Infizierbarkeit beobachtet, falls die dominant aktiven Isoformen von Cdc42 und Rac1 sowie die dominant inaktive Isoform von Cdc42 exprimiert wurden. Im Gegensatz dazu zeigten weitere Isoformen und die Wildtyp Proteine keinen Effekt auf die Infizierbarkeit. Ko-Expressionsexperimente zeigten, dass dieser inhibierende Einfluss auf die Infizierbarkeit nicht über Hemmung des ICP0 Promotors vermittelt wird. Zusätzlich wurden Infektionsstudien von stabil transfizierten MDCKII Zellen durchgeführt, die dominante Isoformen von Cdc42 und Rac1 nach Induktion exprimierten. Die Expression von dominant aktivem Rac1 und dominant inaktivem Cdc42 nicht aber von dominant aktivem Cdc42 führte zu einer signifikanten Reduktion der HSV-1 Infizierbarkeit. Ein unterschiedlicher Verlauf der Aktivierungskaskaden von Rho GTPasen in transient und stabil transfizierten MDCKII Zellen könnte für den unterschiedlichen Effekt von dominant aktivem Cdc42 auf die HSV-1 Infizierbarkeit verantwortlich sein. Untersuchungen zum Einfluss der Cdc42/Rac1 Signaltransduktionswege auf die HSV-1 Infizierbarkeit ergaben keine Hinweise auf eine direkte Beteiligung von PAK-1 oder N-WASP in diesem Prozess. Diese Ergebnisse ergaben erste Hinweise auf eine Rolle der Cdc42/Rac1 Signaltransduktionswege und möglicherweise der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts im Prozess des HSV-1 Eintritts.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Investigations on entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into epithelial cells English
Translated abstract:	Abstract Language Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) initiates infection of the host organism via cells of mucosal epithelial tissues. The cellular entry process of HSV-1 relies on the interaction of several viral glycoproteins with various cell surface receptors followed by penetration of the plasmamembrane and transport to the nucleus. This study aims to understand viral entry into epithelia in vivo. HSV-1 entry into individual epithelial cells was visualized by staining of ICP0, a viral immediate early (IE) gene product. Infection studies in the epithelial cell line MDCKII and in primary keratinocytes indicate the polar entry of HSV-1 via basolateral membranes. When human foreskin epithelia were infected HSV-1 entered exclusively via basal cells. These observations indicate, that efficient viral entry relies on the accessibility to basolateral membranes. In order to elucidate the HSV-1 entry mechanism into epithelial cells potential molecular determinants were studied. Staining of the potential coreceptor Nectin-1 revealed no correlation of receptor localisation and virus entry sites in keratinocytes. The involvement of HSV-1 glycoprotein D in viral entry was confirmed by blocking experiments. First pharmacological inhibition experiments in MDCKII cells yielded no evidence for an entry mechanism that relies on endocytotic uptake and pH-dependent membrane fusion. Since infected MDCKII cells and keratinocytes exhibited features of migrating cells, processes during migration might contribute to viral entry. Reorganisation of the actin cytoskeleton during cell migration is regulated through signalling pathways controlled by the Rho-like GTPases Cdc42, Rac1 and RhoA. Upon transient expression of dominant isoforms in MDCKII cells, a significant decrease of infectivity was observed, when dominant active isoforms of Cdc42 and Rac1 and a dominant inactive isoform of Cdc42 were expressed. In contrast other isoforms and the wildtype versions of the GTPases had no significant effect on infectivity. Transient co-expression experiments demonstrated that this inhibitory effect on viral infectivity was not mediated through transcriptional repression of the ICP0 promotor. In addition, infection studies of stably transfected MDCKII cells were carried out which expressed dominant isoforms of Cdc42 and Rac1 upon induction. Expression of dominant active Rac1 and dominant inactive Cdc42 led to a sigificant decrease in viral infectivity, whereas expression of dominant active Cdc42 had no significant effect. Differences in the activational cascades of Rho GTPases might account for the different effect of dominant active Cdc42 upon HSV-1 infectivity in transiently and stably transfected MDCKII cells. Investigations of Cdc42/Rac1 signalling pathways yielded no evidence for a direct involvement of PAK-1 and N-WASP in this process. These results provide first evidence for a potential role of Cdc42/Rac1 signalling pathways and possibly actin dynamics in HSV-1 entry. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schelhaas, Mario Mario.Schelhaas@epost.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-11110
Date:	2003
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Ehemalige Fakultäten, Institute, Seminare > Faculty of Mathematics and Natural Sciences > no entry
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HSV-1 , Eintritt , Rho GTPasen , Nectin-1 , Epithelzellen German HSV-1 , entry , Rho GTPases , Nectin-1 , epithelial cells English
Date of oral exam:	4 February 2004
Referee:	Name Academic Title Knebel-Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1111