Systematische Untersuchungen von Proteininteraktionen der MYB und bHLH Transkriptionsfaktoren aus Arabidopsis thaliana

Zimmermann, Ilona (2003). Systematische Untersuchungen von Proteininteraktionen der MYB und bHLH Transkriptionsfaktoren aus Arabidopsis thaliana. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden die Protein-Protein-Interaktionen von Transkriptionsfaktoren aus den MYB- und bHLH-Familien aus Arabidopsis thaliana untersucht. Mit Hilfe der Hefe 2-Hybridtechnik wurden Wechselwirkungen zwischen beiden Familien analysiert und in Screenings neue Interaktionspartner identifiziert. 1) Die Hefe 2-Hybrid-Technologie wurde so weiterentwickelt, dass manuell eine Hoch-Durchsatz Leistung zur Identifizierung von Interaktionspartnern in cDNA Bibliotheken erreicht werden kann, die bisher nur mit automatisierten Verfahren möglich war. 2) In einer systematischen Interaktionsanalyse wurde gezeigt, dass MYB-Transkriptionsfaktoren vom R2R3- wie auch vom 1R-Typ mit bHLH-Proteinen der Subgruppe IIIf spezifisch interagieren. Mit Hilfe von Deletionsanalysen, Mutagenesen und bioinformatischen Methoden, konnte die Interaktionsdomäne auf einen kurzen Sequenzabschnitt im Bereich der R3/R1-Wiederholung der MYB-Proteine eingegrenzt werden. Die Interaktion beruht auf einem gemeinsamen Motiv Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R, welches in allen MYB-Transkriptionsfaktoren, die mit diesen und homologen bHLH-Faktoren interagieren, innerhalb des Pflanzenreichs konserviert ist. 3) Es wurde für drei bHLH-Faktoren der Subgruppe IIIf gezeigt, dass die mit dem WD40-Protein TRANSPARENT TESTA GLABRA1 interagieren. Die Bindungsdomäne wurde für AtbHLH002 auf einen Bereich von 70 Aminosäureresten eingegrenzt. Dieser Bereich enthält ein Motiv, welches in allen bHLH-Faktoren dieser Subgruppe konserviert ist. 4) Es konnten neuartige Protein-Protein-Wechselwirkungen von MYB- bzw. bHLH-Faktoren mit Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren und verschiedenen anderen Proteinen gezeigt werden. Besonders auffällig war eine Proteinfamilie, die über einen konservierten Sequenzbereich im C-terminalen Bereich mit bHLH-Faktoren der Subgruppe III interagieren. 5) Bei verschiedenen Vertretern der bHLH-Familie wurde außerdem eine Heterodimerisierung mit anderen bHLH-Faktoren gefunden. Die Interaktion zwischen AtbHLH013 und AtbHLH003 konnte auf Seiten von AtbHLH003 auf die bHLH-Domäne eingeschränkt werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

English abstract In this work, protein-protein interactions within members of the MYB and bHLH-transcription-factor (TF) families of Arabidopsis thaliana have been investigated. The yeast-two-hybrid approach was used to dissect the specificity of the interactions of both families to each other, and to identify new MYB and bHLH TF interaction partners. 1. An improved yeast-two-hybrid-screening was established during this work, which resulted in an efficient high-throughput method. The efficiency is comparable to automated yeast-two-hybrid approaches. 2. This systematic work revealed the specific interaction of the R2R3 and the 1R-type of MYB-TFs with subgroup IIIf of the bHLH-protein family. Deletion analysis, mutagenesis, and bioinformatics was used to map the interaction domain to a part of the R3/(R1)-repeat present in the MYB-TFs . The molecular interaction is based on the common motif Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R conserved in the MYB-proteins, that bind to this bHLH proteins. This consevation is also present in other plant species. 3. It was demonstrated that three bHLH-transcription factors of subgroup IIIf molecularly interact with the WD40-protein Transparent Testa Glabra 1 (TTG1). The interaction domain was mapped to a stretch of 70 amino acids in AtbHLH002, which contains a motif common to all members of this TF subgroup. 4. With the yeast-two-hybrid approach novel protein-protein interactions between the MYB-proteins and the bHLH-TFs were identified. Additionally the MYB and bHLH-TFs were shown to interact with zinc finger proteins. A further result was the isolation of a protein family that interacted with different bHLH TFs of subgroup III. This interaction was dependent on the C-terminal region conserved in the newly identified protein family. 5. Furthermore bHLH-hetero-dimerisations were identified that have not previously been demonstrated. And it was shown that the interaction of AtbHLH003 to AtbHLH013 was dependent on the bHLH domain of AtbHLH003.

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