Functional studies of phototaxis in Dictyostelium discoideum mutants

Khaire, Nandkumar Krishna (2003). Functional studies of phototaxis in Dictyostelium discoideum mutants. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract Dictyostelium discoideum has proven indispensable to elucidate cytoskeletal dynamics. The cytoskeleton plays a key role in almost all cellular processes, including motility, cytokinesis, cell-to-cell and cell-substrate adhesions and intracellular transport. Several actin binding proteins are also involved in these processes, among them are actin crosslinking proteins (for example, filamin and a-actinin). Filamin (also known as ddfilamin or gelation factor or ABP 120) consists of an actin binding domain and six rod repeats of 100 amino acids, its last repeat being responsible for the formation of the homodimer. Both the domains are necessary for the actin crosslinking activity of filamin. Dictyostelium mutants lacking filamin have severe defects in multicellular slug migration towards light, phototaxis, and preferable temperature, thermotaxis. To study the phototaxis defect in filamin- mutants at the molecular level we expressed various domains in the mutant and tested their rescue potential. Expression of C terminally truncated and point mutated (at a putative phosphorylation site) filamin rescued the phototaxis defect partially. Full-length filamin when expressed under the control of the ecmA promoter in the anterior tip of the slug rescues the phototaxis, but not when expressed under the control of the cotB promoter which allows expression in the posterior ¾th of the slug. Phototaxis is a complex phenomenon, which includes more than 55 genes. To identify genes involved in this process we carried out a microarray analysis. Amoung 65 genes we selected in microarray analysis, 40 genes were up regulated and 25 genes were down regulated. From the functions of most of theses genes, we conclude that the phototactic behaviour of slugs is controlled by extracellular cAMP, Ca2+ ions and cell adhesion. To further focus on filamin's function in phototaxis we searched for proteins interacting with filamin by a yeast two hybrid screen and by immunoprecipitation. TipA, GAPA and SapA proteins were pulled down in the immunoprecipitation approach while the FIP, filamin interacting protein, was found earlier in a yeast two hybrid screen. Biochemical studies suggest that FIP is associated with F-actin and may function in vesicle trafficking. Detailed analysis of the mutants of LIM proteins, villidin and filamin for chemotactic migration towards cAMP, led us to conclude that alteration in chemotactic motility of individual cells may not affect the phototactic migration of the slug.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Das Zytoskelett einer Zelle ist in vielfältige Prozesse involviert. Es ist wichtig für die Bewegung, für Zell-Zell-Kontakte, Zell-Substrat-Anhaftung, für die Zellteilung und für intrazelluläre Transportprozesse. Für die Aufrechterhaltung dieser verschiedenen Funktionen sind neben den Hauptkomponenten des Zytoskeletts, Aktin, Tubulin und Intermediärfilamente, die akzessorischen Proteine der Filamentsysteme von entscheidender Bedeutung wie vor allem Mutantenanalysen gezeigt haben. Die hier vorgestellten Arbeiten sind in Dictyostelium discoideum durchgeführt worden, einem eukaryontischen Mikroorganismus mit einzelligen und mehrzelligen Entwicklungsstadien, der zur Analyse von verschiedenen zellbiologischen Fragestellungen wie der Rolle und Funktion des Zytoskeletts hervoragend geeignet ist. Filamin (Gelationsfaktor, ABP120 oder ddFilamin) gehört zur Gruppe der aktinbindenden Proteine, die Aktinfilamente quervernetzen und den Aufbau von dreidimensionalen Aktinstrukturen ermöglichen. Es besteht aus einer aktinbindenden Domäne und sechs Wiederholungseinheiten von je einhundert Aminosäuren, die für die Ausbildung seiner stäbchenförmigen Struktur verantwortlich sind und über deren letzte Einheit die Dimerisierung des Moleküls erfolgt, die die Grundlage für die Quervernetzungsaktivität von Filamin bildet. Dictyostelium Mutanten, denen Filamin fehlt, sind im multizellulären Slugstadium beeinträchtigt. Slugs orientieren sich normalerweise auf das einfallende Licht hin und wandern darauf zu, während Filamin- Mutanten eine veränderte phototaktische Reaktion aufweisen und in einem Winkel zum Licht hin und über kürzere Strecken wandern. Um zu verstehen, welche Eigenschaft von Filamin für diese veränderte Reaktion verantwortlich ist, sind einzelne Domänen in der Mutante exprimiert und auf ihre Fähigkeit hin, den Phototaxisdefekt zu kompensieren, getestet worden. In diesen Untersuchungen konnte der Phototaxisdefekt vom Motilitätsdefekt getrennt werden, wobei für eine verbesserte Motilität die Expression eines verkürzten Proteins ausreichend war, das aus aktinbindender und verkürzter stäbchenförmiger Domäne bestand und das auf Grund der fehlenden letzten Wiederholungseinheit nicht mehr in der Lage war zu dimerisieren. Der Phototaxisdefekt war dagegen nicht aufgehoben. Dies verweist auf die Bedeutung der Quervernetzungsaktivität des Proteins für diese Aktivität. Eine Mutation in einer potentiellen Phosphorylierungsstelle in der aktinbindenden Domäne korrigierte dagegen den Phototaxisdefekt, beeinträchtigte aber die Slugmotilität. Schliesslich konnte gezeigt werden, dass eine Filaminexpression in den Zellen an der Spitze des Slugs, den sogenannten Tipzellen, ausreicht, um den Phototaxisdefekt vollständig aufzuheben. Diese Daten in Kombination mit Daten aus anderen Gruppen lassen darauf schliessen, dass die Qualität der Spitze entscheidend für die Wirkung des Lichtes ist. Weitere Daten zur Genexpression in der Mutante und die Identifizierung von Filamin-Bindeproteinen weisen auf Veränderungen in der cAMP Signaltransduktion in der Mutante, die die Ursache für die veränderte Slugmotilität sein können

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