Universität zu Köln

Daumke, Oliver (2004). Structural and functional analysis of the GTPase Activating Protein of the small guanine nucleotide binding protein Rap1. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Rap1GAP is the founding member of a family of GTPase activating proteins (GAPs) for the small guanine nucleotide binding protein (GNBP) Rap1, which show no sequence homology to GAPs of other small GNBPs. Rap1 does not have a catalytic glutamine residue which is essential for the intrinsic and GAP mediated GTP hydrolysis of all other small GNBPs. In this thesis, the structure and the mechanism of GAP catalysed GTP hydrolysis are examined. Most GAPs provide a catalytic arginine residue to the GNBP to complement the incomplete catalytic machinery. However, site-directed mutagenesis revealed that Rap1GAP does not employ a catalytic arginine. To understand the novel reaction mechanism, the structure of Rap1GAP was determined by X-ray crystallography to a maximal resolution of 2,9 Å. Initial phases were obtained by selenomethionine substituted crystals and a SIRAS phasing protocol. The structure was built and refined to an Rcryst= 23,4% and an Rfree of 27,6%. Two Rap1GAP dimers were observed in the asymmetric unit, consistent with gel filtration experiments in which also dimerisation was observed. A Rap1GAP monomer consists of two domains. Both domains show a mixed alpha-beta fold and were named dimerisation and catalytic domain, respectively. Surprisingly, the catalytic domain has structural similarity to the G domain of GNBPs itself suggesting a common evolutionary origin. No structural similarity to any other GAP was observed. By site-directed mutagenesis, it was shown that dimerisation is not required for GAP function. However, both domains are necessary for full catalytic activity. Mutations around a highly invariant helix, the putative interaction helix, dramatically reduced GAP activity. Using a single-turnover fluorescence reporter assay it could be conclusively proven that Rap1GAP employs a catalytic asparagine from the interaction helix to stimulate GTP hydrolysis in Rap1. In the absence of this asparagine side-chain Rap1GAP was completely inactive but could still bind to Rap1●GTP. In contrast to the wild-type, the Rap1GAP(N290A) mutant can not associate with a transition state mimic of Rap1 GTP hydrolysis. Thus, Rap1GAP is the first example of a GAP which provides a catalytic asparagine for catalysis. Based on the analysis of various mutants, a model for the interaction of Rap1GAP with Rap1 is proposed. The results of this thesis have implications for the disease Tuberous sclerosis. Loss of function mutations in the Rap1GAP homologue Tuberin are associated with this disease and can be rationalised in the view of this work.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Strukturelle und funktionelle Analyse des GTPase aktivierenden Proteins des kleinen Guaninnukleotid-bindenden Proteins Rap1 German
Translated abstract:	Abstract Language Rap1GAP ist das Gründungsmitglied einer Familie GTPase-aktivierender Proteine (GAPs) für das kleine Guaninnukleotid-bindende Protein (GNBP) Rap1. Diese Familie besitzt keine Sequenzgemeinsamkeit zu GAPs anderer GNBPs. Im Gegensatz zu fast allen anderen kleinen GNBPs hat Rap1 keinen katalytischen Glutaminrest, der sonst essentiell für die intrinsische und GAP vermittelte GTP-Hydrolyse ist. In dieser Arbeit wurde die Struktur und der Reaktionsmechanismus von Rap1GAP untersucht. Die meisten GAPs stellen dem GNBP ein katalytisches Arginin zur Verfügung. In Rap1GAP konnte jedoch durch Mutationsanalyse kein katalytischer Argininrest identifiziert werden. Daraufhin wurde die Struktur eines katalytischen Fragments von Rap1GAP durch Röntgenstrukturanalyse bis zu einer maximalen Auflösung von 2,9 Å aufgeklärt. Das Phasenproblem wurde durch Selenomethionin-substituierte Kristalle und ein SIRAS-Phasierungsprotokoll gelöst. Ein molekulares Modell wurde erstellt und bis zu einem Rcryst-Wert von 23,4% und einem Rfree-Wert von 27,5% verfeinert. In vorangegangenen Gelfiltrations-Experimenten wurde Dimerisierung von Rap1GAP beobachtet, und zwei Rap1GAP-Dimere befanden sich in der asymmetrischen Einheit des Kristalls. Ein Rap1GAP-Molekül ist aus zwei Domänen aufgebaut, die Dimerisierungs- und katalytische Domäne genannt wurden. Sie bestehen jeweils aus einem zentralen beta-Faltblatt mit umgebenden alpha-Helices. Die katalytische Domäne zeigt überraschend strukturelle Ähnlichkeit zur G-Domäne der kleinen GNBPs. Dies deutet auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung von Rap1GAP und den GNBPs hin. Zu GAPs anderer Familien konnte keine strukturelle Ähnlichkeit entdeckt werden. Durch Mutationsanalysen wurde gezeigt, dass die Dimerisierung von Rap1GAP für die Katalyse nicht erforderlich ist, aber beide Domänen benötigt werden. Eine Helix in der katalytischen Domäne, deren Sequenz in der Rap1GAP-Familie hochkonserviert ist, wurde als Interaktionshelix für Rap1 identifiziert. Mutationen in dieser Helix und in ihrer unmittelbaren Nähe führen zu starkem GAP-Aktivitätsverlust. Mit Hilfe einer fluoreszenzbasierten Nachweisreaktion konnte eindeutig gezeigt werden, dass Rap1GAP ein katalytisches Asparagin aus der Interaktionshelix für die Katalyse bereitstellt. Eine Mutation dieses Restes zu Alanin inaktiviert Rap1GAP, ohne die Bindung von Rap1●GTP zu beeinflussen. Im Gegensatz zum Wildtyp-Protein kann die Asparagin-Mutante nicht mit einem Übergangszustands-Analogon der Rap1-GTP-Hydrolyse assoziieren. Dies ist das erste Beispiel eines GAPs, das ein katalytisches Asparagin zur Katalyse bereitstellt. Mit Hilfe dieses Befundes und weiterer Mutationsanalysen wurde ein Interaktionsmodell für Rap1GAP mit Rap1 erstellt. Diese Ergebnisse dieser Arbeit sind für die Krankheit Tuberöse Sklerose relevant, die durch inaktivierende Punkt-Mutationen im Rap1GAP-Homologen Tuberin ausgelöst werden kann. Die Ursachen des Funktionsverlusts können durch die strukturellen und biochemischen Befunde dieser Arbeit besser verstanden werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Daumke, Oliver oliver.daumke@mpi-dortmund.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-11711
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language GTPase , GAP , Reaktionsmechanismus , katalytisches Asparagin , Proteinstruktur German GTPase , GAP , reaction mechanism , catalytic asparagine , protein structure English
Date of oral exam:	17 May 2004
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1171